Prdx2通过Wnt/β-catenin信号通路调控结肠癌细胞生长的研究

【摘要】第一部分Prdx2在结肠癌的表达及临床意义目的：检测Prdx2在结肠癌组织及细胞株中的表达,探讨Prdx2与临床病理特征之间的关系及与β-catenin表达的相关性。方法：1.免疫组织化学方法检测Prdx2和β-catenin在35例人结肠癌组织及其相应的正常结肠粘膜组织中的表达，并分析Prdx2与临床病理特征之间的关系，Spearman’s法分析Prdx2与β-catenin表达可能存在的相关性。2.Real-TimePCR方法检测Prdx2与β-catenin在人结肠癌组织、正常结肠粘膜组织及结肠癌细胞株、正常结肠粘膜细胞株中mRNA的表达水平。3.Westernblot方法检测Prdx2与β-catenin在人结肠癌组织、正常结肠粘膜组织总蛋白中的表达水平以及在结肠癌细胞株、正常结肠粘膜细胞株总蛋白与核蛋白中的表达水平。4.免疫荧光技术检测Prdx2与β-catenin在结肠癌细胞株中的共表达情况。结果：1.Prdx2与β-catenin在结肠癌组织中均具有异常表达，两者之间有显著的相关性（P<0.05）。Prdx2的表达与结肠癌患者的TNM分期和转移有关（P<0.05）。2.Prdx2与β-catenin的mRNA表达水平在结肠癌组织及结肠癌细胞株SW480、SW620中相对于其在正常结肠粘膜组织及正常结肠粘膜细胞株FHC中显著升高，Prdx2mRNA的表达量在结肠癌组织为正常结肠粘膜组织中Prdx2mRNA表达量的（7.05±0.26）倍，在结肠癌细胞株SW480、SW620中分别为正常结肠粘膜细胞株FHC中Prdx2mRNA表达量的（3.56±0.15）倍、（5.03±0.22）倍（P<0.05）。3.Prdx2与β-catenin在结肠癌组织中的总蛋白表达水平较其在正常结肠粘膜组织分别高（5.11±0.3）倍、（4.84±0.17）倍；Prdx2与β-catenin在结肠癌细胞株SW480、SW620中的总蛋白的表达水平与其在正常结肠粘膜细胞株FHC中的表达水平比较均显著升高（P<0.05）；Prdx2与β-catenin在结肠癌细胞株SW480、SW620中的核蛋白的表达水平较其在正常结肠粘膜细胞株FHC中的表达水平亦明显增加（P<0.05）。4.免疫荧光检测结果显示Prdx2与β-catenin的表达共同定位于细胞核中。结论：Prdx2与β-catenin在结肠癌组织和细胞株中均具有高表达，两者的表达有显著正相关，且Prdx2的表达与结肠癌患者的TNM分期和转移密切相关。第二部分Prdx2shRNA对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响目的：观察沉默Prdx2基因表达后结肠癌细胞增殖和凋亡特性的变化。方法：1.通过MTT法和流式细胞术分别检测Prdx2基因沉默后结肠癌细胞SW480和SW620的增殖、凋亡变化情况。2.采用活性氧检测试剂盒检测Prdx2基因干扰后SW480和SW620细胞内ROS的含量变化。3.通过MTT法、流式细胞术检测抗氧化剂NAC对Prdx2基因沉默的SW480和SW620细胞增殖、凋亡的影响。4.SW480和SW620细胞接种裸小鼠后，观察Prdx2shRNA对结肠癌细胞移植瘤生长的影响。结果：1.MTT法实验结果显示：与对照组相比，转染Prdx2shRNA的结肠癌细胞SW480、SW620的增殖能力明显降低，流式细胞仪检测结果提示结肠癌细胞SW480、SW620在Prdx2基因干扰后的凋亡率均较对照组明显增加（P<0.05）。2.活性氧检测结果发现Prdx2基因沉默后，结肠癌细胞SW480、SW620的内源性ROS的含量较对照组显著增加（P<0.05）。3.抗氧化剂NAC作用Prdx2基因沉默的结肠癌细胞SW480、SW62024h后，细胞的增殖能力明显提高，凋亡率显著降低（P<0.05）。4.Prdx2干扰组移植瘤瘤体的平均体积明显低于对照组（P<0.05）。结论：Prdx2沉默能够抑制结肠癌细胞SW480、SW620的增殖和促进结肠癌细胞凋亡，可能与Prdx2沉默后细胞内ROS的含量增加有关。第三部分干扰结肠癌Prdx2调控Wnt/β-catenin通路的实验研究目的：观察Prdx2基因沉默后Wnt/β-catenin通路相关因子表达的变化,探讨Prdx2对结肠癌生长影响的作用机制。方法：1.应用Westernblot检测Prdx2shRNA转染结肠癌细胞后Wnt/β-catenin通路关键因子β-catenin在胞浆和胞核中表达水平的变化以及该通路其它相关因子p-β-cateninser33/37,GSK-3β,p-GSK-3βser7和下游靶基因c-Myc,Survivin的蛋白表达情况；Real-TimePCR方法检测下游靶基因c-Myc,SurvivinmRNA表达情况。2.细胞免疫荧光技术检测Prdx2沉默后β-catenin在细胞内定位的变化情况。3.Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV-939对转染Prdx2shRNA的结肠癌细胞SW480、SW620生物学特性影响的实验。分组（两种细胞均分为5组）：①溶剂对照组：DMSO；②空白对照组：XAV-939(－)与Prdx2shRNA(－)；③单独干扰组：XAV-939(－)与Prdx2shRNA(＋)；④单独抑制剂组：XAV-939(＋)与Prdx2shRNA(－)；⑤干扰联合抑制剂组：XAV-939(＋)与Prdx2shRNA(＋)。方法：通过MTT法和流式细胞术分别检测各组结肠癌细胞的增殖和凋亡情况。4.Westernblot检测Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV-939对结肠癌细胞SW480、SW620内源性Prdx2蛋白表达的影响。结果：1.Westernblot结果显示：Prdx2沉默后，结肠癌细胞中β-catenin蛋白表达水平在胞核中明显降低，胞浆中明显增加（P<0.05）,而β-catenin的总蛋白水平较对照组没有明显变化；p-β-cateninser33/37和GSK-3β的蛋白表达量明显升高,p-GSK-3βser7，c-Myc和Survivin的蛋白表达量显著下降（P<0.05）；Real-TimePCR结果提示c-Myc和SurvivinmRNA水平较对照组明显降低（P<0.05）。2.免疫荧光结果提示，Prdx2沉默后，SW480、SW620细胞中的β-catenin由胞核移位至核外。3.MTT检测结果显示单独抑制剂组和单独干扰组均较空白对照组SW480、SW620细胞的增殖能力均明显减弱（P<0.05），而干扰联合抑制剂组细胞的增殖能力与单独干扰组相比没有更进一步减弱；流式细胞仪检测结果提示单独抑制剂组和单独干扰组的凋亡率均较空白对照组明显增加（p<0.05），而干扰联合抑制剂组细胞的凋亡率较单独干扰组也没有进一步增加。4.XAV-939作用于结肠癌细胞SW480、SW620后，两种细胞的Prdx2蛋白表达水平明显下调（p<0.05）。结论：Prdx2基因沉默能抑制Wnt/β-catenin通路相关因子的表达，Prdx2可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响结肠癌细胞的生长。
【作者】卢伟东；
【导师】傅仲学；
【作者基本信息】重庆医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】Prdx2；β-catenin；结肠癌；RNA干扰；增殖；凋亡；Wnt/β-catenin通路；

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