副溶血性弧菌中密度感应系统依赖的T3SS1和T6SS2调控机制研究

【摘要】副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus，VP）是一种海洋微生物，主要生存于海水，港口水环境及附着在海产品上，人们主要通过食用未煮熟的污染的海产品而感染，目前副溶血性弧菌已经成为引起食物中毒的首要病原菌。密度感应系统（quorum-sensing，QS）是细菌中广泛存在的细菌之间的信号传递机制，主要通过合成，释放及感应自身诱导因子（autoinducers，AI）来感受生存环境的变化，继而调控与细菌菌密度相关的系列基因的转录表达。副溶血性弧菌QS系统影响细菌很多生物学功能，如生物膜的形成，菌落透明度的变化，细菌的运动能力等。AphA和OpaR是副溶血性弧菌QS系统的2个主要转录调控子，分别在低菌密度（lowcelldensity，LCD）和高菌密度（highcelldensity，HCD）时高表达，并介导细菌在LCD和HCD之间进行转换。三型分泌系统（Type3SecretionSystems，T3SS）是细菌蛋白分泌装置，通过把毒力效应蛋白注射入宿主细胞内引起细胞损伤。副溶血性弧菌T3SS1以诱导宿主细胞程序性死亡或自噬的方式介导细菌的细胞毒性。副溶血性弧菌六型分泌系统Ⅱ（Type6SecretionSystems2，T6SS2）主要介导其对宿主细胞的粘附作用,粘附是细菌与宿主细胞相互作用的首要步骤，是引起致病的必要条件。副溶血性弧菌T3SS1和T6SS2是其关键的的毒力因子，参与其致病的多种生物学功能。本课题着重研究QS中心调控子AphA和OpaR对T3SS1和T6SS2的具体转录调控机制。副溶血性弧菌T3SS1主要受exsACDE操纵子的调控。在副溶血性弧菌近缘菌哈氏弧菌中，QS系统中心调控子LuxR通过抑制exsA基因的表达来间接抑制T3SS1的表达。但是在副溶血性弧菌中QS系统调控T3SS1的详尽机制并未报道。根据生物信息学预测，副溶血性弧菌中QS系统可能也是通过作用于exsACDE操纵子来调控T3SS1的转录；且根据操纵子结构实验我们确定了4个相应的靶基因进行研究，exsC、exsB、exsD和VP1687（T3SS1效应蛋白基因）。副溶血性弧菌T6SS2受OpaR蛋白的转录调控，OpaR蛋白促进其表达，但是详细的调控机制并未报道。根据生物信息学及相关文献报道推测：QS系统可能通过直接作用于T6SS2的基因簇来调控其转录与表达。T6SS2基因簇由3个操纵子组成，我们选择了每个操纵子的首位基因作为靶基因来进行研究，即T6SS2的靶基因为VPA1027、VPA1043和VPA1044。本研究利用自杀质粒pDS132对aphA和opaR基因进行了缺失，并以pBAD33质粒为载体进行了相应基因的回补，利用pET蛋白表达系统在大肠杆菌BL21（λDE3）中获得了His-AphA和His-OpaR的重组蛋白，随后用凝胶阻滞实验（electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA）和DNA酶I足迹实验（DNaseIfootpritingassay）研究调控子与靶基因启动子区之间的关系，并用引物延伸实验和LacZ报告基因融合实验研究调控子对靶基因的调控关系，继而详细阐述调控机制。实验结果表明：AphA通过激活exsC、exsB和exsD基因的转录来促进T3SS1（VP1687）的转录，继而促进细菌对宿主细胞的细胞毒性；OpaR通过抑制exsC、exsB和exsD基因的转录来抑制T3SS1（VP1687）的转录，继而抑制细菌对宿主细胞的细胞毒性。AphA和OpaR结合在exsB基因的启动子区序列上，直接调控其的转录表达。AphA和OpaR对exsC和exsD的作用均是间接的。这个结果表明在菌密度较低时aphA大量表达从而促进T3SS1表达，致使微量的细菌就可以引起感染；在菌密度较高时opaR抑制T3SS1的表达，使细菌对宿主的致病力下降，进而促进其排出宿主体外，利于细菌的传播。AphA间接负向调控VPA1027、VPA1043和VPA1044的转录从而抑制T6SS2的转录；OpaR结合于这3个靶基因的启动子区直接正向调控T6SS2的转录。这表明T6SS2可能在细菌感染的后期起主要作用，维持细菌的毒力。本研究首次利用生物信息学及经典的分子生物学实验详细的阐述了QS系统依赖的T3SS1和T6SS2转录调控机制，为重塑副溶血性弧菌基因调控网络，揭示其致病机理提供了理论基础。
【作者】王丽；
【导师】王润华；邱景富；
【作者基本信息】重庆医科大学，临床检验诊断学，2014，博士
【关键词】副溶血性弧菌；三型分泌系统Ⅰ；六型分泌系统Ⅱ；转录调控；

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