地塞米松改善足细胞细胞骨架损伤的分子机制研究

【摘要】原发性肾病综合征(NS)是小儿常见的肾小球疾病,其中以微小病变(MCD)为主要病理类型,约占75%-90%,临床主要表现为大量蛋白尿,低蛋白血症,水肿,高血脂,大部分患儿对糖皮质激素治疗敏感,尽管在人类和动物模型中进行了广泛研究,围绕NS发病机制和蛋白尿形成机制以及糖皮质激素的治疗机制仍不十分清楚。自上世纪50年代以来,糖皮质激素开始用于治疗儿童肾病综合征,约90%的NS患儿对激素治疗敏感,NS相关的死亡率由治疗前的35%下降到3%,口服糖皮质激素开始成为治疗儿童NS的一线用药；临床上虽然已经进行了大量的临床试验和meta分析,探讨针对儿童合适的治疗策略,以期更合理的应用糖皮质激素的治疗作用减少其相应的副作用,但是仍有约60%肾病综合征患儿存在频复发,需要长期应用糖皮质激素,而长期激素治疗可以诱发和加重感染,感染又可致疾病反复和死亡率增加,同时可以引起生长迟缓,免疫抑制,高血压,抑制伤口修复,骨质疏松以及代谢紊乱等激素相关的副作用,给患儿及家长造成了很大的经济和心理负担。因此明确蛋白尿的发生机制及糖皮质激素的治疗作用机制仍是对儿童肾脏病工作者的挑战。1974年Shalhoub提出“可溶性介质假说”(solublemediatorhypothesis),指出微小病变肾病综合征(MCNS)主要是由于免疫系统功能紊乱导致相关的细胞因子及炎症介质分泌异常所致。围绕这一假说,在人与NS模型中展开了很多研究,发现IL-2、IL-8、肿瘤坏死因子α(TNF-a)等在NS患儿中表达增高,但在疾病缓解期则与正常组无差异；进一步动物实验发现,IL-8、TNF-α可以导致实验动物产生蛋白尿；提示这些细胞因子可能参与了NS蛋白尿的发生。而糖皮质激素正是基于这一假说治疗NS,糖皮质激素可以通过与糖皮质激素受体(GR)结合形成GC-GR复合物,与负糖皮质激素元件结合,从而抑制转录因子与该基因结合,从而达到抑制IL-2、IL-8、TNF-α等的表达,达到治疗目的。但是随着对肾小球超微结构的认识,人们发现在MCNS’肾活检组织标本以及嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的NS模型中,光镜和电镜下肾组织中均未见有炎症细胞的浸润、免疫复合物沉积等,仅存在肾小球脏层上皮细胞即足细胞足突的融合和裂孔隔膜的消失,提示足细胞变化包括形态和功能的变化在蛋白尿产生中起了更直接的作用。而足突融合程度与蛋白尿呈正相关,这种变化与足突的细胞骨架肌丝重排和分布异常有关,其中足细胞相关分子也发生了变化,对足细胞裂孔隔膜相关分子(nephrin、podocin、CD2AP)及细胞骨架分子α-actinin-4的进一步研究发现这些分子基因的突变和表达异常与先天性肾病及FSGS相关,是维系足细胞正常形态功能所必须的；裂孔隔膜不仅是足细胞信号转导的平台,也是足细胞与骨架蛋白actin目互作用的平台,以上证据强烈提示,NS最根本是足细胞的病变。而近期的研究发现足细胞上存在糖皮质激素受体,糖皮质激素可以通过受体和非受体途径,改善足细胞的损伤。体外研究发现地塞米松具有直接减少足细胞凋亡的能力,还可以通过稳定足细胞细胞骨架,减少细胞骨架的重排,改善足细胞的黏附性从而达到减少蛋白尿的目的。在MCNS发生发展过程中,存在多种蛋白分子的参与。本课题组前期应用基因芯片技术发现：MCNS患儿的血管生成素样蛋白3(angiopoietin-likeprotein3,ANGPTL3)mRNA的表达水平显著高于正常儿童；应用激光微切割技术分离肾组织发现在阿霉素大鼠肾病模型的肾小球内ANGPTL3mRNA和蛋白的表达随着蛋白尿的加重而表达增高；进一步运用Western免疫印迹和实时荧光定量PCR技术发现体外培养的足细胞正常表达ANGPTL3比较低,但在PAN诱导足细胞损伤模型中发现,损伤24小时后ANGPTL3mRNA和蛋白的表达均明显高于正常对照组；以上结果均提示／ANGPTL3可能参与了MCNS相关的蛋白尿。地塞米松对足细胞损伤的保护作用分子机制如何?是否与足细胞相关热点分子有关?而ANGPTL3是否参与了足细胞损伤过程及可能的分子机制,目前国内外尚无这方面的研究和报道。本研究以体外培养的小鼠足细胞株(MPC5)为研究对象,给予或不给予地塞米松1μM预处理,再给予PAN50μg/ml处理24小时,首先以细胞免疫荧光法和激光共聚焦显微镜观察足细胞形态和通透性改变。结果显示,与对照组比较,PAN诱导损伤组F-actin紊乱不均匀,部分荧光强度增强,胞膜间连接呈不连续,胞浆内荧光强度变暗,应力纤维几乎消失；地塞米松预处理之后PAN所致的F-actin排列紊乱改善,F-actin分布重新趋于正常状态,荧光强度增强。进一步荧光强度值比较发现PAN损伤组明显低于对照组(282.6±74.65vs1209.0±403.39),而地塞米松预处理之后再给予PAN损伤组荧光强度值与PAN损伤组相比明显增强(1030.0±101.24vs282.6+74.65)；利用两室弥散系统进一步通过检测外源性标记FITC-牛血清白蛋白(BSA)的滤过量,来评价足细胞通透性的变化,结果显示：与对照组相比,PAN损伤组FITC-BSA的滤过率明显增加为40.7%±7.6%；而给予地塞米松预处理后再给予PAN损伤,FITC-BSA的滤过率较前明显降低(6.8%±2.6%)。进一步探讨地塞米松对PAN所致足细胞损伤保护作用是否与足细胞相关热点分子相关,本实验结果显示,地塞米松可以以使正常足细胞相关分子nephrinmRNA和蛋白水平表达均增高,而podocin和α-actinin-4mRNA表达无明显变化；PAN损伤组足细胞相关分子nephrin、podocin和α-actinin-4mRNA水平的表达均增高,而地塞米松预处理组可以抑制这种表达增高；进一步蛋白水平的比较发现,PAN损伤组与对照组相比podocin蛋白变化不明显,但地塞米松在保护足细胞损伤的同时可以导致podocin、nephrin与α-actinin-4蛋白的表达下降。提示地塞米松保护PAN损伤同时伴有足细胞相关热点分子的改变。我们同时观察了地塞米松是否影响ANGPTL3的表达,结果发现PAN损伤组ANGPTL3mRNA和蛋白表达均增高,而地塞米松可以抑制ANGPTL3的异常表达；进一步实验结果显示地塞米松对正常足细胞ANGPTL3的表达无影响。采用瞬时转染方法高表达和低表达ANGPTL3,观察细胞骨架F-actin和足细胞通透性的变化,结果发现高表达ANGPTL3组足细胞F-actin的分布和荧光强度出现了类似PAN所致的损伤,足细胞单层膜通透性增加,FITC-BSA的滤过率增加,而低表达ANGPTL3组足细胞F-actin的分布和荧光强度与空质粒转染组无明显差异,单层膜足细胞通透性无明显变化；提示高表达ANGPTL3可以引起足细胞损伤,而地塞米松可以保护ANGPTL3所致足细胞损伤。进一步观察ANGPTL3与nephrin、podocin和α-actinin-4之间是否存在密切联系,结果显示ANGPTL3高表达使nephrin和α-actinin-4mRNA和蛋白表达均增高,但对podocinmRNA表达无影响；而ANGPTL3低表达对足细胞相关分子的表达无明显影响；提示ANGPTL3引起足细胞损伤过程中可能有nephrin和α-actinin-4参与作用。给予地塞米松处理ANGPTL3高表达组后,观察到足细胞损伤减轻的同时,nephrin和podocinmRNA水平和蛋白水平的表达均降低,但不能改变α-actinin-4的表达。综上所述,本课题通过地塞米松对足细胞损伤保护作用的分子机制研究发现PAN所致足细胞损伤过程中,ANGPTL3表达显著增高,地塞米松不仅可以保护PAN所致足细胞损伤,同时抑制ANGPTL3的高表达。地塞米松在保护PAN所致足细胞损伤和质粒瞬时转染所致ANGGPTL3高表达所引起的足细胞损伤中,一定程度上可能与目前足细胞相关的热点分子有关。
【作者】刘海梅；
【导师】徐虹；
【作者基本信息】复旦大学，儿科学，2010，博士
【关键词】地塞米松；足细胞；嘌呤霉素氨基核苷；血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)；裂孔隔膜分子；质粒转染；

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