CRABP2基因在肝癌的表达及对肝癌HCCLM3细胞恶性生物学行为的影响

【摘要】研究背景和目的:肝癌是全世界范围内第六大常见的恶性肿瘤和第三大癌症相关致死病因。肝细胞肝癌是成年人最常见的肝脏恶性肿瘤。目前肝癌高致死率的主要原因是缺乏有效的治疗手段，对于早期肝癌缺乏明确的筛选指标。肝癌的预后往往较差，尽管经过手术、放疗、化疗、介入手段等治疗后，肝癌的5年生存率仅有约7%。对于进展期肝癌，有效治疗手段的缺乏促使人们不断探索新的治疗策略。关于肿瘤细胞增殖、分化、血管发生、侵袭、转移的癌基因及信号通路研究给我们指出了一些可能的治疗靶点，促进了分子靶向治疗的发展。细胞维甲酸绑定蛋白2(CellularRetinoicAcidBindingProtein2,CRABP2)是一种细胞脂质绑定蛋白，与维甲酸RA的转运相关。CRABP2在细胞质中与RA结合，转运其入核后使维甲酸在细胞核中与其受体RARs相互作用以调节各种生理作用，如胚胎发生、凋亡、细胞增殖、分化等。CRABP2在癌症的发展过程中起着重要的作用。它的表达与功能在多种癌症中有文献报道，如胃癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈肿瘤、肾母细胞瘤等。HCCLM3是一种人肝癌转移细胞株，具有较高的转移潜能，由复旦大学附属中山医院肝癌研究所建系。前期实验发现经由RNA和蛋白检测，CRABP2在转移性肝癌细胞HCCLM3中的表达量均高于非转移性肝癌细胞Huh7、Hep3B、HepG2。既往研究证实CRABP2与癌症病人的生存及预后有着一定联系。关于CRABP2是否能够影响转移性肝癌细胞HCCLM3的恶性生物学特性，目前尚无相关报道，因此在本研究中，我们探讨了CRABP2在转移性肝癌细胞HCCLM3中的生物学作用及可能的机制，以期明确CRABP2是否能作为肝癌基因治疗的一个新的治疗靶点。方法:1.采用RealTime-PCR和WesternBlot检测肝癌细胞（HCCLM3、Huh7、Hep3B、HepG2）和人肝细胞L02中CRABP2的mRNA和蛋白的表达。2.免疫组化方法检测人肝癌和癌旁的组织芯片，比较CRABP2在肝癌组织与癌旁组织的表达。3.设计并合成针对CRABP2基因的siRNA，分别在siRNA干扰HCCLM3细胞48h和72h后提取RNA和蛋白质，通过RealtimePCR和WesternBlot检测干扰效率。4.CCK-8法检测siRNA干扰CRABP2对HCCLM3细胞体外增殖的影响；流式细胞仪检测siRNA干扰CRABP2对HCCLM3细胞凋亡和周期的影响；使用BD公司生产的8μm孔径的24孔板用培养小室检测siRNA干扰CRABP2后HCCLM3细胞的体外迁移和侵袭能力变化。5.构建CRABP2shRNA稳定干扰逆转录病毒载体及阴性对照载体并稳定感染肝癌细胞株HCCLM3：利用逆转录病毒载体pMKO.1构建出干扰CRABP2的pMKO.1-CRABP2shRNA，选用293T细胞进行病毒包装，将病毒载体感染HCCLM3细胞，通过测序和westernblot检测，建立起稳定的CRABP2基因shRNA干扰HCCLM3细胞株。6.构建CRABP2慢病毒过表达载体并稳定感染肝癌细胞株HCCLM3：利用慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP构建出过表达CRABP2的pCDH-CRABP2，选用293T细胞进行病毒包装，将病毒载体感染HCCLM3细胞，通过测序和westernblot检测，建立起稳定的CRABP2基因过表达HCCLM3细胞株。7.利用CRABP2shRNA稳定干扰的HCCLM3细胞株，建立裸鼠皮下移植瘤，研究了CRABP2基因干扰对HCCLM3细胞体内成瘤能力和生长、增殖的影响，westernblot检测了瘤块的CRABP2蛋白表达情况。8.采用Westernblot方法检测了病毒稳定干扰和稳定过表达CRABP2后HCCLM3细胞株的MAPK信号通路、Cyclins/CDKs、VCAM1、ADH1C、c-Myc、NF-κB的蛋白水平表达变化。稳定干扰实验分为阴性对照组pMKO.1-NC和稳定干扰组CRABP2shRNA；稳定过表达实验分为空载体组pCDH-Vector和稳定过表达组pCDH-CRABP2。9.Real-timePCR进一步验证CRABP2稳定干扰和过表达时蛋白表达水平改变的基因mRNA变化，包括CDK2、CyclinE1、CDK4、CDK6、CyclinD1、MKK4、JNK、c-Jun、VCAM1及ADH1C。结果:1.通过RNA和蛋白检测，发现CRABP2在转移性肝癌细胞HCCLM3中的表达量均高于非转移肝癌细胞Huh7、Hep3B、HepG2和人肝细胞L02。2.组织芯片的免疫组化结果发现，CRABP2在肝癌组织和癌旁组织的细胞浆中均有表达，无明显差异；但CRABP2在肝癌组织细胞核中的染色强度和比率都高于癌旁组织细胞，计算的染色分数差异有显著性。3.特异性siRNA在50nM的浓度下对HCCLM3细胞内CRABP2的表达起到了有效的干扰作用：在作用48h后，其mRNA的转录下调了60%以上，72h后的蛋白表达量也明显降低。4.CCK-8实验结果：与对照组比较，在50nM的特异性siRNA干扰后HCCLM3细胞的增殖被抑制。流式细胞术检测细胞周期结果显示，在siRNA干扰CRABP2表达72h后，HCCLM3细胞G0/G1期的比例没有明显变化，S期的细胞减少明显，G2/M期的细胞增多明显。细胞凋亡的结果显示：干扰组与对照组细胞的凋亡率变化不明显。siRNA干扰后HCCLM3细胞的迁移侵袭能力受到抑制。5.应用pMKO.1载体成功构建了pMKO.1-CRABP2shRNA逆转录病毒载体，病毒包装后经稳转HCCLM3细胞株有效干扰了CRABP2基因的表达。6.应用pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(pCDH)载体成功构建pCDH-CRABP2慢病毒载体，病毒包装后经稳转HCCLM3细胞株使CRABP2基因有效高表达。7.裸鼠成瘤实验结果显示，CRABP2-shRNA组细胞在裸鼠体内肿瘤生长速度减慢，成瘤能力下降，移植瘤体积和重量均低于对照组。8.Westernblot结果表明：稳定干扰CRABP2组的CDK2、CyclinA、CyclinE1、CDK4、CDK6、CyclinD1、MKK4、JNK、c-Jun、VCAM1和ADH1C的蛋白表达水平明显低于阴性对照组（P＜0.05）；p38MAPK、MEK1/2、ERK1/2、c-Myc和NF-κB分子的蛋白表达水平无明显改变（P＞0.05）。进一步用稳定过表达CRABP2的HCCLM3细胞来反向验证，证实稳定过表达CRABP2后细胞的上述蛋白表达变化刚好与稳定干扰的细胞蛋白表达变化相反。CRABP2稳定过表达组细胞CDK2、CyclinA、CyclinE1、CDK4、CDK6、CyclinD1、MKK4、JNK、c-Jun、VCAM1和ADH1C的表达水平明显高于空载体组（P＜0.05）。9.在稳定干扰CRABP2时，Real-timePCR结果显示：稳定干扰组的CDK2、CyclinE1、CDK4、CDK6、CyclinD1、MKK4、JNK、c-Jun、VCAM1及ADH1C的mRNA表达水平低于阴性对照组。在稳定过表达CRABP2时，Real-timePCR结果显示：稳定过表达组的CDK2、CyclinE1、CDK4、CDK6、CyclinD1、MKK4、JNK、c-Jun、VCAM1及ADH1C的mRNA表达水平高于空载体组。Real-timePCR检测的上述基因mRNA变化与Westernblot检测的蛋白变化趋势是一致的。结论:本研究显示CRABP2在转移性肝癌细胞HCCLM3中的表达高于非转移肝癌细胞Huh7、Hep3B、HepG2和人肝细胞L02。CRABP2在肝癌组织细胞核中的表达高于癌旁组织细胞。干扰CRABP2表达能抑制HCCLM3细胞的体外增殖，引起细胞周期阻滞，对细胞凋亡无影响，降低迁移和侵袭能力。我们成功构建并感染了稳定干扰或稳定过表达CRABP2基因的HCCLM3细胞株，稳转细胞株用于后续实验。CRABP2促进了肝癌细胞HCCLM3的裸鼠体内成瘤。CRABP2主要通过MKK4/JNK/c-Jun信号传导轴而调控HCCLM3细胞的生物学行为；同时影响了VCAM1和ADH1C的表达而促进HCCLM3细胞的迁移侵袭和肿瘤进展；通过影响部分Cyclins/CDKs的表达，异常调节了细胞周期，进而使细胞过度增殖。
【作者】郭颖；
【导师】李少林；
【作者基本信息】重庆医科大学，肿瘤学，2014，博士
【关键词】肝细胞肝癌；CRABP2；JNK；细胞增殖；迁移侵袭；

【参考文献】
[1]戴璐.胎儿民事权益保护发展变化研究[D].郑州大学,法律,2013,硕士.
[2]王化冰.拉赫玛尼诺夫与他的《c小调第二钢琴协奏曲》[D].山西大学,音乐学,2004,硕士.
[3]李文刚.GL人力资源管理信息系统的建设[D].华中师范大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[4]诺炎（KatarzynaBuczek）.希腊金融危机对欧盟的影响[D].哈尔滨工业大学,国际贸易学,2013,硕士.
[5]彭定川.马克思生态理论研究[D].西北师范大学,马克思主义哲学,2013,硕士.
[6]周春蕾.东营凹陷大芦湖油田古近系沙三中亚段沉积体系研究[D].中国地质大学（北京）,矿产普查与勘探,2014,硕士.
[7]赵欢.脉冲电弧液电放电压载水处理效果的研究[D].华中科技大学,高电压与绝缘技术,2013,硕士.
[8]吴娟.江苏省工业企业创新行为研究[D].南京大学,产业经济学,2013,硕士.
[9]陈丽.Android GUI自动化测试框架设计与实现[D].华中科技大学,控制工程,2013,硕士.
[10]伊莉娜.清末民初伶人公益事业研究[D].山西师范大学,戏剧戏曲学,2013,硕士.
[11]张静蕊.基于CD4立体构型设计的小分子免疫抑制剂的生物学评价[D].中国人民解放军军事医学科学院,免疫学,2004,硕士.
[12]胡保坤,朱群雄.基于数据仓库的石化工程预算决策系统[J].北京化工大学学报(自然科学版),2005,02:107-109.
[13]戴利彬.打造移动IPRAN传送网[J].电信网技术.2008(04)
[14]梁虹.论附条件不起诉制度[D].华南理工大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[15]李恩成.基于微流控芯片技术COPD向肺鳞癌恶性转化的机制研究[D].大连医科大学,内科学,2014,博士.
[16]左怀玲.人教版《义务教育课程标准实验教科书·数学》七年级上册第四章“数据的收集与整理”简介[J].中小学教材教学,2004,27:5-8.
[17]唐加福,张艳娥,董颖.供应商参与的部件设计方案的模糊综合评判[J].控制与决策,2006,05:576-579.
[18]刘晓平,张嗣瀛.大规模不确定离散动态系统的分散控制[J].自动化学报,1992,01:120-123.
[19]关阿娜.包头市三家综合医院住院分娩产妇产后抑郁现状及影响因素研究[D].山东大学,公共卫生（专业学位）,2012,硕士.
[20]王炜.船钢战略联盟模式及其运行评价研究[D].江苏科技大学,企业管理,2013,硕士.
[21]张小辉.基于阻抗变化测量的串联电抗器匝间短路微机保护的研究[D].哈尔滨理工大学,高电压与绝缘技术,2013,硕士.
[22]孙青峰.基于空间句法分析的城市商业街区空间建构研究[D].北方工业大学,建筑设计及其理论,2014,硕士.
[23]唐永辛.公平视野下高校学生资助制度研究[D].华中师范大学,教育管理,2012,硕士.
[24]希玲（ValiantsinaHalauko）.本地化战略实施背景下高层管理团队中权利分配对国际合资企业的影响研究[D].浙江工商大学,企业管理,2013,硕士.
[25]王贺朋.脐血多能干细胞对重症斑秃的临床治疗及相关免疫机制研究[D].河北医科大学,皮肤病与性病学,2014,硕士.
[26]郑双怡.文本挖掘及其在知识管理中的应用[J].中南民族大学学报(人文社会科学版),2005,04:127-130.
[27]张宇航.我国商业银行绿色信贷业务发展策略研究[D].吉林大学,金融,2013,硕士.
[28]丁雯.左旋棉酚通过诱导细胞自噬调节其杀伤Namalwa细胞能力的研究[D].西南大学,微生物与生化药学,2013,硕士.
[29]孙宗伟.异质机构投资者对高管薪酬激励影响的研究[D].山东财经大学,企业管理,2014,硕士.
[30]李敏.基于对外汉语中高级阶段复合词的修辞派生义研究[D].湖南师范大学,对外汉语,2014,硕士.
[31]郭芬芬.全麻纤维的综合利用及木质素对纤维素酶吸附的研究[D].山东大学,微生物学,2014,博士.
[32]刘建昌,王立平,王贞祥,武玉新,候克封,许文刚.前馈AGC中奇异信号的预处理[J].冶金自动化,1995,02:25-27.
[33]陶端健.催化反应精馏过程的应用基础及其技术扩展[D].南京大学,绿色过程化学,2011,博士.
[34]袁俊杰.中国证券市场的量子辨识[D].郑州大学,应用数学,2013,硕士.
[35]吴昊.我院近三年可切除直肠癌诊疗模式演变[D].苏州大学,临床医学（专业学位）,2013,硕士.
[36]黄沈阳.污染环境罪研究[D].北京交通大学,2014.
[37]郭廷凯.镁—铝异种金属无匙孔搅拌摩擦点焊工艺与性能的研究[D].兰州理工大学,材料加工工程,2013,硕士.
[38]谢永芳,桂卫华,吴敏.基于线性矩阵不等式的分散H_2/H_∞控制的次优设计[J].自动化学报,2000,02:263-266.
[39]张中.医用轨道物流传输系统调度规划研究与仿真系统设计[D].南京航空航天大学,机械电子工程,2014,硕士.
[40]赵嵘.钢琴演奏中强化听觉的训练方法研究[D].中国音乐学院,音乐学,2012,硕士.
[41]吴妮娅.基于Web的日志挖掘技术的研究[D].哈尔滨工程大学,2004.
[42]马德堂,朱光明,范廷恩.二维TTI介质中初至波旅行时的搜索算法[J].石油地球物理勘探,2011,05:710-714+836+661.
[43]卢权观.提高液压压下系统轧机两侧行程速度同步精度的一种控制方法[J].冶金自动化,1996,01:46-47.
[44]王洪香.基于激光散射法对纳米颗粒测量的研究[D].哈尔滨理工大学,高电压与绝缘技术,2012,硕士.
[45]李晓林.胡仙信仰的实践逻辑[D].沈阳师范大学,社会学,2013,硕士.
[46]陈俊忠.基础隔震和加层减震结构地震响应分析与地震作用取值[D].广西大学,结构工程,2004,硕士.
[47]支晓波.行政人员品德塑造机制研究[D].河海大学,马克思主义理论与思想政治教育,2004,硕士.
[48]牛昆仑.当代中国公共部门人力资源绩效考核分析[D].吉林大学,行政管理,2004,硕士.
[49]郭莉敏.现代俄语简单句的逻辑表达式问题[D].首都师范大学,俄语语言文学,2004,硕士.
[50]张亮.甘蔗联合收割机刀盘仿形随动控制系统的设计与研究[D].河南科技大学,机械电子工程,2014,硕士.