红松多酚分离鉴定及抗氧化抗癌功能研究

【摘要】红松(Pinuskoraiensis)又名果松,属于松科植物。主要分布于我国东北长白山到小兴安岭一带。红松树皮中含有大量的多酚类物质,它具有抗氧化、抗癌、增强免疫系统活性等作用。因此,从红松中筛选和评价具有强抗氧化、抗癌、增强免疫的活性组分具有一定的重要意义。本文选取红松树皮为实验原料,系统的研究了松多酚提取、纯化工艺,并确定40%乙醇洗脱物(PKB)为研究对象,对PKB的主要成分进行了结构鉴定。分析了PKB的体外、体内抗氧化活性,增强小鼠免疫系统活性和抗癌活性,并对抗氧化活性与抗癌细胞增殖活性、增强免疫功能与抗癌细胞增殖活性进行了相关性分析。实验结果显示,PKB具有较强的抗氧化、抗癌细胞增殖活性和增强小鼠免疫系统活性,抗氧化活性与抗癌细胞增殖,增强免疫功能与抗癌细胞增殖活性具有良好的相关性。主要研究结果如下：采用酶解预处理结合乙醇浸提法提取红松树皮多酚化合物。以多酚得率为指标,在单因素试验基础上,采用响应曲面法对红松树皮多酚的提取工艺进行优化,确定最优提取工艺为：加酶量126.1U/g,酶解时间2.68h,酶解温度55.4℃,乙醇添加量48.2%。在该最优提取条件下多酚得率的高达12.11mg/g,与超声波法提取法相比多酚得率提高了46.95%。对红松树皮多酚的分离纯化条件进行研究,考察了六种大孔吸附树脂对红松树皮多酚静态、动态吸附解吸效果,从两个方面进行考察,结果发现D101大孔树脂具备较好的吸附和解吸红松多酚的性能,最终选取D101为纯化树脂。其最优条件为：上样液浓度为2.5mg/mL,上柱液pH值为3.0,洗脱剂乙醇的最佳解吸浓度为70%；解吸过程中,洗脱剂用量为4BV；吸附分离后的多酚得率由原来的12.03%提高到59.9%,纯化效果较好。将松多酚粗提物用大孔吸附树脂D101进行纯化,分别用20%、40%、60%、80%浓度的乙醇梯度洗脱,选取40%乙醇洗脱物为研究对象,用半制备液相色谱仪进行二级纯化并收集样品,采用紫外光谱仪、红外光谱仪、质谱仪、核磁共振对其进行分析和结构鉴定,结果发现40%乙醇洗脱物主要成分为五羟基二氢黄酮。收集40%乙醇洗脱物中间四分之一段,样品中五羟基二氢黄酮含量达到50%,命名为PKB。系统的研究了PKB的体外抗氧化能力和体内抗氧化能力。在体外抗氧化能力研究中,分别考察了DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基、超氧自由基的清除能力和总还原能力,并与Vc标准品进行对比,实验结果表明,PKB具有良好的抗氧化效果。在体内抗氧化能力研究中,构建辐射诱导的氧化损伤模型,实验结果表明,PKB各剂量组可明显减少小鼠各脏器中丙二醛(MDA)含量,提高过氧化氢酶(CAT)活性、乳酸脱氢酶(LDH)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物(GSH-Px)活性和增加还原型谷胱甘肽(GSH)的含量。能够有效的抑制氧化酶系,激活抗氧化酶系,保护细胞膜的损伤。研究表明PKB可增强小鼠免疫系统活性,结果显示,PKB可以有效改善辐射后小鼠生存状态,提高小鼠免疫调节器官脾脏、胸腺指数,增加单核巨噬细胞的吞噬能力。细胞周期分布显示与模型组比较,PKB加药组使阻滞于G1期的细胞减少而S期和G2期细胞增多,呈极显著性差异(p<0.01),细胞增殖能力得到恢复。实验结果显示,PKB可有效保护小鼠免疫系统,降低了辐射带来的机体免疫抑制。研究了PKB对MFC-7、BGC-823、Hela以及HT-29癌细胞的增殖抑制活性,结果显示,PKB对HT29癌细胞的抑制活性最强。通过透射电镜和扫描电镜对凋亡细胞进行观察。采用琼脂糖凝胶电泳验证PKB可以使细胞膜损伤产生DNA-Ladder碎片,同时用流式细胞仪检测PKB对HT29癌细胞周期和细胞凋亡情况。结果显示,PKB可以从不同角度诱导细胞凋亡。揭示了PKB的抗氧化性与抗癌作用之间存在相关性,增强免疫与抗癌作用之间存在相关性。进一步证实了PKB具有较好的功能活性,对于揭示PKB预防由自由基引发的氧化损伤的作用机制以及开发研制新型抗癌药物具有重要的理论和实际意义。
【作者】黄雨洋；
【导师】王振宇；
【作者基本信息】东北林业大学，森林植物资源学，2014，博士
【关键词】松多酚；分离纯化；抗氧化；抗癌；生理功能；

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