SIRT1调节TNF-α诱导退变髓核细胞趋化因子MCP-1表达及相关作用机制

【摘要】第一部分人退变髓核组织中髓核细胞的体外分离、培养目的：熟悉并掌握原代髓核细胞分离、提取、培养技术，为后续实验提供足够的细胞来源。方法：肉眼分离髓核组织，利用0.25%胰酶联合II型胶原酶提取髓核细胞，采用COL2A1免疫荧光实验对髓核细胞进行鉴定。通过WesternBlot和实时荧光定量PCR实验比较冻存、未冻存、平面、藻酸盐三维培养对髓核细胞COL2A1表达影响。结果：成功运用0.25%胰酶联合II型胶原酶提取出髓核细胞，COL2A1免疫荧光结果与髓核细胞相符。髓核细胞冻存后COL2A1表达明显减少（P<0.05），藻酸盐三维培养髓核细胞能够增加COL2A1表达（P<0.05）。结论：胰酶、II型胶原酶联合消化法能够成功提取髓核细胞。髓核细胞冻存后表型丢失，而藻酸盐三维培后表型可得到一定恢复。第二部分SIRT1对TNF-α诱导髓核细胞表达趋化因子MCP-1的影响目的：明确SIRT1对TNF-α诱导髓核细胞表达趋化因子MCP-1的影响。方法：TNF-α在不同时间（12小时/24小时）不同剂量（5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml）诱导髓核细胞后，通过流式细胞周期观察细胞增殖情况，WesternBlot，实时荧光定量PCR实验检测表达MCP-1情况。在SIRT1激动剂白藜芦醇、SIRT1抑制剂尼克酰胺、SIRT1小干扰RNA预处理细胞后，利用WesternBlot、实时荧光定量PCR检测TNF-α诱导髓核细胞表达MCP-1情况。结果：各组TNF-α刺激对细胞活性无显著影响（P>0.05），TNF-α刺激髓核细胞在24小时，20ng/ml浓度时MCP-1表达最高（P<0.05）。SIRT1激动剂白藜芦醇预处理明显减少TNF-α诱导髓核细胞MCP-1表达（P<0.05），SIRT1抑制剂尼克酰胺预处理明显增加TNF-α诱导髓核细胞MCP-1（P<0.05）表达。SIRT1小干扰RNA转染明显增加TNF-α诱导髓核细胞MCP-1表达（P<0.05）。结论：实验证明SIRT1能够抑制TNF-α诱导髓核细胞表达MCP-1。第三部分SIRT1抑制TNF-α诱导退变髓核细胞MCP-1表达的相关作用机制目的：探索SIRT1能够抑制TNF-α诱导髓核细胞表达MCP-1可能存在的作用机制。方法：利用AP-1抑制姜黄素和TNF-α处理髓核细胞，WesternBlot及实时荧光定量PCR实验检测MCP-1表达情况。SIRT1激动剂白藜芦醇和TNF-α处理细胞后，免疫荧光实验、WesternBlot（核蛋白）检测c-Jun（AP-1亚基）定位及表达情况。通过EMSA实验检测白藜芦醇、SIRT1小干扰RNA预处理后，TNF-α诱导髓核细胞中AP-1活性。结果：使用AP-1抑制剂姜黄素处理后，TNF-α诱导髓核细胞MCP-1表达明显减少（P<0.05）。免疫荧光和WesternBlot（核蛋白）发现SIRT1激动剂白藜芦醇可以减少AP-1亚基c-Jun在核内表达（P<0.05）。EMSA实验发现SIRT1激动剂白藜芦醇预处理能够抑制髓核细胞中AP-1活性，SIRT1小干扰RNA转染后AP-1活性增加（P<0.05）。结论：SIRT1能够具有抑制TNF-α诱导髓核细胞表达MCP-1的作用，这种作用可能通过抑制AP-1活性有关。
【作者】罗意；
【导师】胡侦明；
【作者基本信息】重庆医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】髓核细胞；COL2A1；藻酸盐三维培养；细胞冻存；SIRT1；MCP-1；姜黄素；EMSA；

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