RaGAPDH的发现及其在R.anatipestifer致病中的作用研究

【摘要】研究背景：鸭疫里默氏杆菌（Riemerellaanatipestifer，R.anatipestifer）是属黄杆菌科黄杆菌属的一种革兰氏阴性小杆菌，有荚膜、无芽胞、无鞭毛，可引起鸭、鹅、火鸡及其他多种鸟类发生感染。鸭的感染为最常见，被称为鸭传染性浆膜炎，感染后可出现全身浆膜的纤维素性渗出，产生以心包炎、肝周炎、气囊炎为主要特征的病理变化，导致感染鸭体重减轻。鸭传染性浆膜炎具有高发病率、高死亡率的特点。R.anatipestifer血清型多达21个，血清型间缺乏有效的交叉免疫保护。流行血清型的不断变化，耐药性的日渐增强，以及由疫苗和抗生素预防、治疗引发的食品安全问题，使R.anatipestifer越来越成为危害全球养鸭业最为严重的病原之一。自邝荣禄等（1975）首次报道分离到R.anatipestifer以来，现已报道了四株菌的全基因组序列，其中包括ATCC11845、RA-GD、RA-YM、RA-SG，但在关于其致病机制的研究中，除已经被证实的毒力相关蛋白（VapD）、协同溶血素（CAMP）、外膜蛋白A（OmpA）、明胶酶和能形成生物膜外，其致病的分子基础和机制还知之甚少。三磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）是一种具有独特亚细胞分布的多功能活性蛋白。在真核细胞中，GAPDH除在经典糖酵解途径中将D-3-磷酸甘油醛转化成1，3-二磷酸甘油酸作用外，还参与真核细胞的许多基本生命活动，如：维持DNA的完整性，调控组蛋白基因；参与受体介导的细胞信号转导；保护端粒DNA，调控转录后基因，引起细胞自噬、细胞凋亡和氧化应激反应等。由于GAPDH具有跨物种的高度保守结构，常常被用作基因调控、催化机理相关研究和作为Northern/Western-blot分析的模式蛋白或参考标准。近年的研究发现，某些细菌，如布氏杆菌、链球菌、大肠杆菌；真菌，如白色假丝酵母菌；寄生虫，如利什曼原虫、恶性疟原虫、牛血吸虫和生殖支原体等也产生GAPDH，而且是这些病原体的重要致病因子，在宿主细胞的信号转导中发挥重要作用，进而有助于病原体对宿主细胞的粘附和感染。基于GAPDH在某些病原微生物致病过程中发挥的重要作用，该酶已成为研制抗疟疾、血吸虫病、EPEC和EHEC感染等多种严重危害人类健康的疾病的药物靶标，具有显著的理论和应用研究价值。研究目的：本文经生物信息学分析发现在R.anatipestifer基因组序列中也存在GAPDH编码基因的同源序列，并首次从18株临床分离的R.anatipestifer细胞表面检测出GAPDH酶活性，从而证实R.anatipestifer也产生GAPDH，将此酶命名为RaGAPDH，其编码基因命名为gap。在此基础上，研究RaGAPDH在R.anatipestifer的分布及其与宿主的相互作用，为深入研究RaGAPDH在鸭传染性浆膜炎致病过程中的作用，探索其致病的分子机制及新的防治措施奠定基础。研究内容及结果：1．发现和证实R.anatipestifer能产生GAPDH对分离自四川、重庆地区的22株R.anatipestifer细胞表面的GAPDH活性进行检测，其中18株的细胞表面检测出GAPDH酶活性，并且不同菌株细胞表面酶活性存在差异。对细胞表面有GAPDH活性的两株菌在不同培养时间点进行胞外GAPDH活性检测，胞外蛋白中的GAPDH酶活性与其细胞表面的活性一致。RT-PCR检测证实，菌株的胞外GAPDH酶活性高低与其编码基因的表达水平一致。2.RaGAPDH分子特征的初步分析采用染色体步移技术对RaGAPDH编码基因进行克隆、测序分析，该基因大小为1002bp，编码334个氨基酸，理论分子量为35947.07Da，等电点为7.0。将编码蛋白的氨基酸序列提交SWISS-PROT数据库进行分析，其二级结构包含NAD+结合区（I4-C152）和催化区（L157-Y314）两个结构域，不含信号肽或跨膜区，属于Ⅰ型GAPDH。采用MEG2.0构建的遗传进化树显示，RaGAPDH的氨基酸序列在不同地区分离株中高度保守，属单一起源，与EHEC/EPEC亲缘关系最近，处于同一分支。3.RaGAPDH的毒性作用及其定域分析构建了R.anatipestifergap基因的原核表达载体pET-28a(+)-gap，经IPTG诱导表达、纯化获得比活力为6U/μg的重组RaGAPDH。该蛋白能与凝血系统的纤溶酶原及纤维蛋白原发生结合，经颈静脉注射四川麻鸭后可引起其肝脏、大脑血管充血、曲张。与对照组比较，其血液WBC较对照组显著增高（P<0.01），但红细胞（RBC）、淋巴细胞（LT）及血清葡萄糖（GLU）、总蛋白（TP）、碱性磷酸酶（AKP）、谷丙转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）、总胆固醇（TCHO）水平均无显著变化（P>0.05）。重组RaGAPDH与氟氏佐剂混匀后分别免疫BALB/c小鼠和麻鸭，获得高效价的鼠抗重组RaGAPDH血清。以此为一抗，对产RaGAPDH菌株细胞膜蛋白、细胞周质蛋白及胞外蛋白进行Western-blot分析。结果显示，胞外蛋白中存在一条29.0kDa~44.3kDa的蛋白条带，细胞膜蛋白及周质蛋白均未出现此印迹条带。4.抗重组RaGAPDH血清的免疫保护作用R.anatipestifer在含抗血清的TSB肉汤中培养，其生长率为6.15×103%，高于不含血清对照组的1.31×103%，其生长形态由杆状变为球状，细胞中央区域电子密度降低。20日龄健康四川麻鸭经腿部肌肉注射鸭抗重组RaGAPDH血清后接种CZ2菌株，雏鸭发病率、死亡率均为66.7%，血清的被动免疫保护指数为37.5%，感染鸭肝脏、心脏及大脑载菌量均较对照组无显著差异（P>0.05），但其临床病变指数分别降低至1.00±0.0和1.33±0.0，与对照组差异极显著（P<0.01）。5.构建gap基因的缺失突变株，证实其毒性作用采用自杀性质粒pMEG-375构建了gap基因缺失突变株CZ2△gap。以CZ2△gap基因组为模板，PCR扩增出OmpA、Km基因，未扩增出gap基因。CZ2△gap的16sRNA基因序列与CZ2野生株同源性为100%；其形态、染色特性、生化特征与CZ2野生株无明显差异，但生长速度减慢，细胞胞外GAPDH活性消失；感染鸭胚成纤维细胞后其胞内细菌数量为1.2×104CFU/ml，显著低于CZ2野生株（1.7×104CFU/ml）（0.01<P<0.05）。结论：（1）首次发现并证实R.anatipestifer能产生有活性的胞外RaGAPDH，不同菌株酶活性存在的差异与其编码基因的表达水平相关。RaGAPDH属于Ⅰ型GAPDH，含334个氨基酸，分子量为35947.07Da，等电点为7.0，其二级结构包含NAD+结合区（I4-C152）和催化区（L157-Y314）两个结构域，不含信号肽或跨膜区。在不同地区分离株中，RaGAPDH高度保守，属单一起源，均与EHEC/EPEC亲缘关系最近，处于同一分支。（2）成功构建了RaGAPDH编码基因的原核表达载体，获得了具有活性的重组RaGAPDH及其抗血清。重组RaGAPDH能与血纤溶酶原和纤维蛋白原结合，引起鸭肝脏、大脑充血，血管迂曲扩张，对动物组织、器官有毒性作用，抗血清能中和其毒性并为R.anatipestifer感染的雏鸭提供部分被动免疫保护作用。（3）成功构建了gap基因的缺失突变株CZ2△gap。CZ2△gap的胞外RaGAPDH酶活性丧失，对鸭胚成纤维细胞侵袭力下降。表明RaGAPDH可能是R.anatipestifer重要的毒力因子，在其致病过程中发挥作用。
【作者】高继业；
【导师】杨致邦；
【作者基本信息】重庆医科大学，病原生物学，2014，博士
【关键词】鸭疫里默氏杆菌；三磷酸甘油醛脱氢酶；gap；基因；鸭疫里默氏杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶；胞外蛋白酶；

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