肝再生增强因子在急性T淋巴细胞白血病中的表达及其功能的实验研究

【摘要】第一部分：肝再生增强因子在急性T淋巴细胞白血病中的表达及作用研究目的：肝再生增强因子（Augmenterofliverregeneration,ALR）在多种组织细胞中均有表达，发挥促增殖、抗凋亡、免疫调节等作用，但其在急性T淋巴细胞白血病（T-cellacutelymphoblasticleukemia，T-ALL）中的表达及作用尚未明确。本部分课题拟检测ALR在T-ALL细胞中的表达；研究外源性的ALR（重组人ALR，rhALR）对T-ALL细胞的生长增殖和凋亡的影响。实验一：肝再生增强因子在急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat中的表达及作用研究方法：采用荧光定量PCR及westernblot检测T-ALL细胞株Jurkat中ALR的mRNA及蛋白质水平的表达。MTS方法检测外源性的ALR对Jurkat细胞增殖以及长春新碱诱导的细胞抑制的影响；流式细胞仪检测外源性ALR对Jurkat细胞凋亡率和周期分布的影响；westernblot检测凋亡相关蛋白pro-PARP、pro-caspase8、pro-caspase3、Bcl-2、Bax及周期相关蛋白cdc25c、cyclinB1、P53、cdc2的表达情况。结果：T-ALL细胞株Jurkat中ALR的mRNA及蛋白表达水平明显高于正常外周血T淋巴细胞。外源性的ALR对人急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat的增殖、细胞凋亡及周期分布无明显影响，也不影响凋亡及周期相关蛋白的表达（Control组vsrhALR组，P>0.05）；而外源性的ALR可减轻长春新碱引起的细胞抑制（VCR组vsVCR+rhALR组，P<0.05），减少caspase8活化及增加Bcl-2/Bax表达比例从而减少凋亡细胞（VCR组vsVCR+rhALR组，P<0.05），同时增加cdc25c和cdc2的表达，降低cyclinB1及P53的表达来解除G2/M期阻滞（VCR组vsVCR+rhALR组，P<0.05）。实验二：肝再生增强因子在急性T淋巴细胞白血病细胞中的表达及作用研究方法：Ficoll淋巴细胞分离液分离T-ALL患者骨髓白血病细胞。荧光定量PCR及westernblot检测ALR的表达。MTS方法检测外源性的ALR对长春新碱引起的T-ALL细胞抑制的影响。流式细胞仪检测外源性ALR对长春新碱诱导的T-ALL细胞凋亡的影响。westernblot检测凋亡相关蛋白pro-PARP、pro-caspase8、pro-caspase3、Bcl-2、Bax及周期相关蛋白cdc25c、cyclinB1、P53、cdc2的表达情况。结果：6例急性T淋巴细胞白血病患者中ALR的mRNA及蛋白表达水平明显高于正常外周血T淋巴细胞。外源性的ALR可减轻长春新碱对T-ALL细胞的抑制作用（VCR组vsVCR+rhALR组，P<0.05），减少caspase8活化及增加Bcl-2/Bax表达比例从而减少凋亡细胞（VCR组vsVCR+rhALR组，P<0.05），同时增加cdc25c及cdc2的表达，降低cyclinB1及P53的表达（VCR组vsVCR+rhALR组，P<0.05）。结论：1.ALR在急性T淋巴细胞白血病中高表达。2.外源性的ALR在体外对急性T淋巴细胞白血病的增殖没有明显作用。3.外源性的ALR能够拮抗化疗药物长春新碱引起的T-ALL细胞损伤。4.外源性的ALR通过减少caspase8的活化、增加Bcl-2/Bax表达比例,从而减少凋亡细胞，发挥抗凋亡作用。5.外源性的ALR通过调节p53及cdc25表达，激活cyclinB1/cdc2复合物，从而减轻VCR引起的G2/M期阻滞。第二部分：下调肝再生增强因子的表达对急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat生物学特性的影响目的：前面的实验中我们证实了ALR在T-ALL中高表达，外源性ALR具有拮抗化疗药物、抗凋亡及周期调节作用，但是外源性的ALR并不能完全反应内源性ALR的生物学作用，本部分拟观察ALR沉默对Jurkat细胞增殖、凋亡、周期分布以及化疗药物敏感性等生物学特性的影响。方法：采用siRNA/ALR慢病毒转染Jurkat细胞，72h后荧光定量PCR检测siRNA片段对ALRmRNA表达的阻断效率，westernblot及荧光免疫细胞染色检测siRNA/ALR片段对ALR蛋白质表达的作用。MTS方法检测ALR沉默对Jurkat细胞增殖及化疗药物敏感性的影响，流式细胞仪检测ALR沉默对Jurkat细胞凋亡率及周期分布的影响，westernblot检测凋亡相关蛋白pro-PARP、pro-caspase8、pro-caspase3、Bcl-2、Bax及周期相关蛋白cdc25c、cyclinB1、P53、cdc2的表达情况。结果：siRNA转染后72小时，siRNA/ALR组ALR表达水平表达较siRNA/control组明显下调（siRNA/ALR组vssiRNA/control组，P<0.05）。siRNA/ALR转染后，细胞的增殖明显受到抑制、细胞凋亡增加、G2/M期细胞比例减少（siRNA/ALR组vssiRNA/control组，P<0.05）；同时，细胞对长春新碱的化疗敏感性增加，siRNA/ALR组的IC50值为1.32±0.17μg/ml，siRNA/control组为4.87±0.52μg/ml。加入长春新碱处理后，siRNA/ALR+VCR组及siRNA/control+VCR组的凋亡率分别为43.75±5.96%和24.59±3.76%，G2/M期比例分别为85.98±6.67%和62.21±1.83%（siRNA/ALR+VCR组vssiRNA/control+VCR组，P<0.05）。ALR沉默后，Jurkat细胞的凋亡蛋白Pro-PARP、Pro-caspase8、Pro-caspase3和Bcl-2的表达均上调（siRNA/ALR组vssiRNA/control组，siRNA/ALR+VCR组vssiRNA/control+VCR组，P<0.05）；同时，周期相关蛋白cdc25c及cdc2的表达上调，cyclinB1及P53表达下调（siRNA/ALR组vssiRNA/control组，P<0.05）；而加入长春新碱处理后，siRNA/ALR组的cdc25c及cdc2较siRNA/control组明显降低，cyclinB1及P53的表达增强（siRNA/ALR+VCR组vssiRNA/control+VCR组，P<0.05）。结论：1.siRNA/ALR可有效阻断ALR的表达。2.ALR干扰可引起细胞凋亡率的增加和G2/M期减少，从而抑制Jurkat细胞的增殖。3.ALR干扰能够增加长春新碱诱导的凋亡和G2/M期阻滞，从而增强Jurkat细胞对长春新碱的化疗敏感性。4.ALR沉默抑制细胞增殖与增加药敏的机制可能与增加caspase8的活化、降低Bcl-2/Bax表达比例，以及调节p53及Cdc25c表达以及CyclinB1/cdc2复合物活性有关。
【作者】沈燕；
【导师】刘杞；
【作者基本信息】重庆医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】急性T淋巴细胞白血病；肝再生增强因子；长春新碱；凋亡；周期阻滞；细胞周期；细胞凋亡；药物敏感性；

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