HBV CccDNA磁性捕获杂交定量PCR方法的建立及应用评价

【摘要】第一部分特异性HBVCccDNA功能化纳米颗粒制备与鉴定目的：制备特异性富集分离CccDNA功能化的磁性纳米颗粒，为建立磁性捕获杂交方法奠定基础。方法：通过化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子，用溶胶法对纳米颗粒进行二氧化硅包壳。在纳米颗粒表面用链霉亲和素修饰，利用链霉亲和素与生物素的亲和作用，将链霉亲和素修饰的纳米颗粒与生物素标记的CccDNA特异性探针进行偶联反应，制备CccDNA功能化纳米颗粒，最后用FITC标记、与纳米颗粒探针完全互补的序列与功能化纳颗粒反应，确定CccDNA功能化纳颗粒米的特性。结果：（1）合成的Fe3O4纳米粒子近似球形，粒度分布较均匀，大小在8-25nm（平均粒径为13.2nm），粒子间无团聚现象，具有良好的分散性且二氧化硅包覆颗粒的分散性明显好于单纯Fe3O4颗粒。（2）从SiO2包裹纳米颗粒的红外光谱图上可看到Si-O和Fe-O的特征峰，它的饱化磁化强度为55emu/g，无磁滞和剩磁现象，表现出明显的超顺磁性现象。（3）每mgSiO2包裹纳米颗粒能固定链霉亲和素的最大量为146μg；每mg链霉亲和素修饰的纳米颗粒能结合生物素最大量为1215ng。（4）通过链霉亲和素-生物素的相互作用能将CccDNA特异性寡核苷酸固定在磁性纳米微粒表面，偶联前后上清液在260nm的特征吸收峰有明显变化，并且偶联后上清液中核酸浓度和OD260值均明显下降。通过OD260值变化计算出亲和素修饰的纳米颗粒最大结合生物素标记探针量约3200pmol/mg。（5）CccDNA功能化纳米颗粒与其互补FITC标记寡核苷酸序列杂交后，用荧光显微镜观察到磁性分离后上清液的荧光信号明显减弱，变性后其上清液荧光强度又明显增强。通过荧光强度改变计算出功能化纳米颗粒对互补探针最大捕获量大约是2000pmol/mg。结论:构建的CccDNA功能化纳米微粒能有效捕获与其互补的序列，其捕获量能达到CccDNA的分离提取要求，为CccDNA定量检测方法建立奠定了基础。第二部分HBVCccDNA标准品的制备与定量目的：通过构建HBV全基因组重组质粒来制备HBVCccDNA标准品，为CccDNA定量方法建立和性能验证提供标准品和质控品。方法：提取慢性乙肝患者血清DNA，用高保真PCR法扩增HBV全基因组片段，通过T-A克隆建立HBV全基因组质粒，以HBV全基因组质粒为模板，经酶切、连接、浓缩、胶回收及纯化等手段构建HBVCccDNA标准品。结果：（1）从慢性乙肝患者血清中扩增出3.2kb左右大小的DNA片段通过T-A克隆插入pMD18-T载体，成功构建重组质粒。重组质粒经HindIII酶消化得到预期的2.7kb和3.2kb两个片段；（2）经测序鉴定，构建的两个质粒分别属HBV基因型B和C，在DR1和DR2区域内设计的4条探针序列和一条上游引物序列都与测序结果中匹配，扩增序列的保真性好，错配率符合要求。（3）两个重组质粒经酶切、连接、胶回收和纯化成功构建CccDNA标准品。两个标准品经real-timePCR定量，它们的浓度分别是1.051010IU/mL和6.19109IU/mL，分别命名为CccDNA-B和CccDNA-C。结论：本部分实验成功构建了HBV全基因组重组质粒和CccDNA标准品，经测序和定量证实，构建的标准品可以作为下一步方法建立和性能验证的标准品和质控品。第三部分HBVCccDNA磁性捕获杂交定量PCR方法建立及初步评价目的:建立磁性捕获杂交定量PCR方法，并对该方法灵敏度、特异性、干扰、检测线性及正确度等评价，以确认建立的方法能满足常规检测需求。方法:设计跨缺口引物选择性扩增磁性杂交捕获分离的CccDNA，建立磁性捕获杂交实时定量PCR方法，将4种不同探针磁性纳米微粒与一定量的标准品杂交不同的时间（1h、2h和3h），确定最适宜的探针和最佳杂交条件；10倍系列稀释HBVCccDNA标准品，取一定量标准品与最有效探针进行杂交分离，检测磁性纳米微粒捕获HBVCccDNA含量，确定方法检测灵敏度和线性；将不同浓度的CccDNA标准品与一定量干扰物混合，检测经磁性纳米微粒捕获的HBVCccDNA含量，以确定方法检测特异性和干扰；用建立的磁性纳米微粒捕获杂交定量PCR法检测细胞株HepG2.2.15连续培养4d细胞中CccDNA含量和检测10例血清标本中CccDNA，对方法进行初步评价。结果:（1）4条探针均能杂交捕获CccDNA，除25-mer探针外，其余3条探针在不同杂交时间内都能达到标准品预期浓度，其中49-mer探针在62℃1h杂交条件下能有效捕获CccDNA，被选为后续实验探针。（2）磁性纳米微粒捕获杂交定量PCR方法检测灵敏度为102IU/mL（20copies/mL），108IU/mLRcDNA对本方法无干扰，MCH-qPCR检测浓度与加入预期浓度之间呈明显线性关系（R2=0.994，F=507.5，p＜0.01），方法正确度与特异性符合要求。（3）HepG2.2.15细胞在连续培养4d后，MCH-qPCR检测其上清CccDNA浓度分别是4.02103IU/mL、1.04102IU/mL、4.38102IU/mL和5.01103IU/mL，质控结果符合预期，表明MCH-qPCR法能从HepG2.2.15细胞株上清中检测出CccDNA。（4）10例CHB患者标本HBVDNA浓度达107IU/mL，8例标本中检测出CccDNA；用功能化纳米微粒对Hirt法提取的tDNA进行MCH-qPCR检测，其检测结果显著低于Hirt提取后的直接检测组，差异具有显著的统计学意义（p<0.01）。结论：成功建立检测CccDNA的MCH-qPCR方法，方法检测灵敏度低（102IU/mL），正确度高，特异性好，符合常规检测要求。第四部HBVCccDNA磁性捕获杂交定量PCR法初步临床应用目的:通过MCH-qPCR方法来检测血清、肝组织及外周单个核细胞内CccDNA及分析CHB血清中CccDNA和血清HBVDNA、ALT等之间的关系，以帮助对MCH-qPCR方法临床应用评价以及了解CccDNA在HBV感染过程中的变化。方法:收集肝脏组织标本、慢性乙肝患者血清标本，经Hirt法提取总DNA后进行HBVDNA和CccDNA检测；收集外周血标本，进行外周血单个核细胞分离后用质粒提取法提取总DNA后进行HBVDNA和CccDNA检测；分析不同标本类型中CccDNA与HBVDNA之间的关系。结果:（1）28例肝组织标本中，21例标本检测出HBVDNA，15例标本检测出HBVCccDNA，它们之间存在明显正相关（p<0.01，R2=0.824）。（2）21例乙肝患者外周血标本中，PBMCs内检测出HBVDNA共7例，检出率33.3%；检测出CccDNA共4例，检出率为19.0%。血清HBVDNA与PBMCs内CccDNA及HBVDNA浓度对数值无相关性（R2=0.111和R2=0.104）。（3）82例乙肝患者血清标本中，检测出CccDNA共48例，检出率为58.5%。35例HBeAg阴性CHB患者有12例血清标本中检测出CccDNA，检出率为34.3%；47例HBeAg阳性CHB患者有36例标本血清检测出CccDNA，检出率为76.6%。ALT水平高低对于CccDNA检测结果无明显影响（pearson=0.04，p=0.851>0.05）。所有82样本HBVDNA与CccDNA之间仅弱的相关性（R2=0.24，F=15.165，p<0.05）；HBeAg阳性组HBVDNA与CccDNA间也有弱的相关性（R2=0.167，F=7.613，p<0.05）；HBeAg阴性组HBVDNA与CccDNA间没有相关性（R2=0.042，F=0.352p＞0.05）。结论:MCH-qPCR方法从肝组织、外周血单个核细胞及血清中均可检测出CccDNA，肝组织中CccDNA水平与HBVDNA呈正相关；外周单个核细胞中CccDNA检出率低且呈低浓度（102~103IU/mL）；血清能检测出102~105IU/mL的CccDNA且与HBeAg状态呈正相关，与HBVDNA有弱相关性。
【作者】郭永灿；
【导师】涂植光；
【作者基本信息】重庆医科大学，临床检验诊断学，2014，博士
【关键词】共价闭合环状DNA；纳米颗粒；偶联；功能化纳米微粒；乙型肝炎病毒；全长基因组；扩增；CccDNA；标准品；质控品；磁性捕获杂交；定量PCR；性能验证；灵敏度；特异性；MCH-qPCR；外周血单个核细胞；肝组织；

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