RNAi沉默HAS2基因对乳腺癌细胞生物学活性的影响及机制研究

【摘要】第一部分HAS2在乳腺癌中的表达及其临床意义目的：探讨HAS2蛋白在乳腺癌组织和正常乳腺组织中是否存在表达差异，并且重点探讨HAS2的异常表达是否与乳腺癌患者临床病理特征之间存在相关性，研究乳腺癌中HAS2的异常表达，为乳腺癌患者早期诊断和判断预后提供的重要的理论基础。方法：这一部分我们使用了免疫组织化学方法，检测55例乳腺浸润性导管癌临床标本和10例乳腺正常组织标本，进行初步的筛选、验证乳腺癌组织中HAS2蛋白是否存在异常表达情况。观察HAS2蛋白在乳腺癌组织及乳腺正常组织中的表达差异，探讨HAS2异常表达与乳腺癌病人临床病理特征之间存在的关系，研究HAS2对乳腺癌患者早期诊断以及预后的意义。结果：HAS2蛋白在乳腺癌组织中呈现高表达，阳性表达率为56.36%，而正常乳腺组织中阳性表达率仅为10%。乳腺癌组织中阳性率明显高于乳腺正常组织(P<0.05)，差异有统计学意义。HAS2蛋白表达水平与乳腺癌患者肿瘤大小、TNM分期以及淋巴结转移相关，而与患者的年龄、ER、PR、CerB-2、P53均无明显相关性。结论：HAS2蛋白在乳腺癌组织中呈现高表达，并且和肿瘤大小、TNM分期以及淋巴结转移相关。HAS2有可能参与了乳腺癌侵袭和转移过程，HAS2检测可作为乳腺癌辅助诊断指标。第二部分特异性HAS2-shRNA抑制乳腺癌细胞增殖侵袭及其机制研究目的：研究下调HAS2的表达对乳腺癌Hs578T细胞增殖、侵袭等恶性行为的影响并探究其机制，以期明确HAS2是否参与而且以何种方式参与了乳腺癌的侵袭和转移。方法：本部分为体外实验部分，首先采用RT-PCR、Real-timePCR和Westernblot方法检测乳腺癌细胞株（BT549、Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3和T47D）HAS2mRNA和蛋白表达水平,然后运用RNA干扰技术,以脂质体Lipofectamine2000转染试剂介导HAS2-shRNA靶向转染人乳腺癌Hs578T细胞。采用Real-timePCR检测HAS2基因沉默情况，随后筛选稳定株以获得稳定转染的Hs578T细胞株，以Westernblot方法对稳定株进行验证。本部分我们使用了克隆形成实验和CCK-8实验以检测下调HAS2对乳腺癌细胞增殖能力的影响；使用划痕实验检测下调HAS2对乳腺癌细胞迁移能力的影响；使用Transwell小室模型检测下调HAS2对乳腺癌细胞侵袭能力的影响；使用HUVEC细胞血管形成实验检测下调HAS2对血管形成的影响；用流式细胞技术检测了转染前后乳腺癌细胞周期和凋亡情况的改变；最后我们使用ELISA-like分析沉默HAS2基因后透明质酸（HA）表达水平是否也随之发生改变。结果：相对于非恶性乳腺上皮细胞，乳腺癌细胞中HAS2mRNA、蛋白水平明显上调，差异有统计学意义（P﹤0.05），并且进一步研究表明乳腺癌细胞Hs578T中HAS2mRNA、蛋白水平均高于其他乳腺癌细胞株。针对HAS2mRNA不同序列区域，我们构建了5组shRNA（HAS2-shRNA1、HAS2-shRNA2、HAS2-shRNA3、HAS2-shRNA4以及Negative-shRNA）。分别转染5组shRNA，Quantitativereal-timePCR检测结果显示，相对于空白对照和Negative-shRNA转染组，4个实验组HAS2mRNA表达均受到不同程度抑制。在成功获得稳定转染HAS2-shRNA3的Hs578T细胞株后进行了一系列与乳腺癌恶性行为相关的功能实验。克隆形成实验和CCK-8实验结果表明下调HAS2可以抑制乳腺癌细胞增殖；划痕实验结果表明下调HAS2后，乳腺癌细胞迁移能力受到抑制；Transwell小室模型实验结果表明下调HAS2后，乳腺癌细胞侵袭能力也收到了抑制；而HUVEC细胞血管形成实验结果说明下调HAS2后可以抑制血管的形成；流式细胞技术检测结果则表明转染HAS2-shRNA3后乳腺癌细胞停滞于G0/G1期，S期细胞数目减少，并且凋亡细胞数目增加；最后ELISA-like分析结果显示沉默HAS2基因后,HA表达水平也随之下降。结论：HAS2-shRNA能够有效沉默HAS2基因，并成功获得HAS2-shRNA稳定转染的Hs578T细胞株，为接下来研究HAS2功能奠定了基础。下调HAS2的表达，可使乳腺癌细胞恶性行为受到抑制，其机制可能是下调HAS2的表达会引起HA合成量的减少，换句话说，有可能HAS2-HA这一动态系统参与了其中。第三部分特异性HAS2-shRNA对乳腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用目的：探讨下调HAS2的表达对乳腺癌细胞裸鼠体内成瘤情况、肿瘤大小、肿瘤重量、有无远处转移以及对裸鼠营养状况的影响。以阐明特异性HAS2-shRNA对乳腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用。方法：收集对数生长期的Hs578T细胞、稳定转染Negative-shRNA的Hs578T细胞和稳定转染HAS2-shRNA3的Hs578T细胞，于裸鼠皮下注射，建立裸鼠皮下移植瘤模型，动态观察裸鼠肿瘤生长状况，从出现肉眼可见瘤体开始记录肿瘤成瘤时间、定期记录肿瘤体积和重量变化。接种28天后，处死裸鼠，剪开皮肤，剥离肿块后称重，对处死的裸鼠进行拍照。肿瘤组织经固定、包埋、切片后通过免疫组化对移植瘤组织进行病理学检测。结果：三组裸鼠皮下注射乳腺癌细胞4天后，在注射部位形成肉眼可见大小不一的肿瘤结节，到第28天结束观察。实验结果表明，空白对照组、Negative-shRNA转染组的移植瘤体积及和重量均明显大于HAS2-shRNA3转染组。空白对照组、Negative-shRNA转染组裸鼠的营养状况明显要差于HAS2-shRNA3转染组。解剖裸鼠，未发现肺部、腹腔等部位有转移灶。组织病理学鉴定结果证实了HAS2-shRNA3转染组瘤体组织内HAS2的表达水平明显发生下调。结论：在体内环境下，HAS2-shRNA仍然可以沉默HAS2基因。下调HAS2表达水平后，裸鼠皮下移植瘤的生长受到抑制，表现为体积缩小，重量减轻。以上实验结果与体外验相一致。
【作者】李鹏；
【导师】任国胜；
【作者基本信息】重庆医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】乳腺癌组织；HAS2；阳性表达；乳腺癌细胞；RNAi；shRNA；恶性行为；HA；裸鼠；皮下移植瘤；

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