拴链因子Exocyst与皮层肌动结合蛋白Cortactin在黏液高分泌中的耦联效应

【摘要】目的明确COPD患者和正常人群支气管上皮和人支气管上皮细胞16HBE细胞株中Exocyst复合物的定位和表达情况。构建离体黏液高分泌细胞模型，探讨拴链因子Exocyst复合物在中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）介导的气道粘蛋白5AC（MUC5AC）高分泌中的调控作用。并就拴链复合物Exocyst和皮层肌动结合蛋白Cortactin在该过程中的耦联作用进行初步探讨。方法(1)目标人群和人支气管上皮16HBE细胞株中Sec3的定位和表达情况免疫组织化学法检测目标人群支气管上皮中Sec3蛋白的分布特征，细胞免疫荧光法检测NE前后16HBE细胞株中Sec3蛋白的胞内分布情况，real-timePCR和westernblotting法分别检测目标人群气管上皮和16HBE细胞株中Sec3mRNA和蛋白的差异性表达。(2)拴链因子Exocyst复合物的促黏液分泌效应构建两条Sec3-shRNA并稳转16HBE细胞株，real-timePCR法和westernblotting法检测Sec3特异性shRNA的沉默效率。给予最适NE浓度和时长刺激16HBE细胞，real-timePCR法和ELISA法观察各组细胞MUC5ACmRNA和蛋白的表达量，明确Sec3亚基在促黏液分泌过程中的调控作用。(3)拴链因子Exocyst和皮层肌动结合蛋白Cortactin的促黏液分泌耦联效应分别构建Cortactin-shRNA和Sec3-shRNA的单独转染和共转染细胞株，real-timePCR法和westernblotting法检测Cortactin-shRNA的沉默效率。Real-timePCR法和ELISA法观察各组细胞MUC5ACmRNA和蛋白的表达量，免疫共沉淀技术和细胞免疫荧光双标技术检测细胞内Sec3和Cortactin的相互作用和共定位，明确Sec3和Cortactin在促黏液分泌过程中的耦联效应。结果(1)目标人群和人支气管16HBE细胞株Sec3的表达情况COPD患者和正常人群支气管上皮细胞均表达有Sec3，均富集于靠管腔面细胞顶端，且COPD患者中Sec3表达明显高于正常人群。人支气管上皮16HBE细胞中表达有Sec3，并主要定位于胞浆中。当给予NE刺激时，细胞中Sec3呈高表达状态，并由胞浆转移至胞膜。(2)拴链因子Exocyst复合物的促黏液分泌效应成功构建了两条特异性Sec3-shRNA，其中Sec3-shRNA1具备较理想的沉默效率。NE可促进MUC5ACmRNA和蛋白的表达增高，并呈剂量依赖性和时间依赖性增加。Sec3-shRNA可显著阻断NE诱导的MUC5AC蛋白胞内高合成和胞外高分泌，但对MUC5ACmRNA高表达的抑制作用并不明显。(3)拴链因子Exocyst和皮层肌动结合蛋白Cortactin的促黏液分泌耦联效应Cortactin-shRNA可明显抑制NE诱导的MUC5AC胞内高表达和胞外高分泌，但对MUC5ACmRNA的高表达抑制作用不明显。并且在联合Cortactin-shRNA和Sec3-shRNA的双重沉默作用情况下，不仅可明显抑制NE诱导的MUC5AC胞内合成，更可完全阻断NE诱导的MUC5AC胞外分泌。免疫共沉淀发现Sec3和Cortactin具有相互作用，在NE刺激时该相互作用明显加强。细胞免疫荧光双标发现明显的重叠信号，具有明显的共定位。结论(1)COPD患者支气管上皮中Sec3呈高表达状态，并富集于靠管腔面细胞顶端；(2)NE可诱导16HBE细胞Sec3的高表达，并促其由胞浆向胞膜转移；(3)NE可呈浓度依赖性和时间依赖性诱导MUC5AC基因和蛋白的高表达；(4)Sec3介导了NE诱导的MUC5AC蛋白胞内高合成和胞外高分泌；(5)Sec3和Cortactin具有耦联促黏液分泌效应，并基本掌控了MUC5AC的胞外分泌过程。
【作者】刘春漪；
【导师】周向东；
【作者基本信息】重庆医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】气道黏液高分泌；粘蛋白5AC；中性粒细胞弹性蛋白酶；Sec3/Exocyst拴链复合物；皮层肌动结合蛋白Cortactin；

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