喉黏膜部位微生物分析及其与喉鳞癌关系的研究

【摘要】喉癌是头颈外科常见的恶性肿瘤,主要的病理类型为鳞状细胞癌。主要危险因素包括吸烟,酗酒以及人乳头状瘤病毒感染等。近年研究报道幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)感染可能与喉癌相关,是喉癌的危险因素,但具体机制还需进一步深入研究。H.pylori是作为独立致病因子还是与其它菌群共同作用而致病尚不清楚。人类微生物组学(Humanmicrobiome)认为人体各解剖部位的菌群,作为一个有机群体通过许多复杂的机制相互协调,共同作用,参与维持微环境的动态平衡。如果微环境菌群结构失代偿,菌群紊乱,则可能导致疾病的产生。本研究通过三个层面分析喉黏膜部位的微生物与喉鳞癌的关系：检测Hpylori是否存在于喉黏膜,分析是否为喉鳞癌的危险因素；分析MSH2与MLHl基因在喉鳞癌中的表达水平,探讨H.pylori是否诱导MSH2与MLH1表达改变而参与介导喉癌的发生；分析喉黏膜部位微生物的生态结构及其与喉鳞癌的动态差异性。第一部分,H.pylori与喉鳞癌的相关性研究。分析H.pylori是否定植于喉黏膜,是否与喉鳞癌存在相关性。采用病例对照研究,分析81例喉鳞癌患者和75例对照人群(声带息肉和会厌囊肿)的Hpylori感染情况。应用巢式聚合酶链反应(Nestedpolymerasechainreaction,nPCR)联合DNA测序,检测两组人群喉部H.pylori感染情况。采用酶联免疫吸附试验(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)检测血清H.py1ori的IgG抗体。通过nPCR检测,结果显示H.pylori存在于喉黏膜,喉鳞癌人群阳性率(71.6%)显著高于对照组人群(28.4%),差异有统计学意义(p<0.001)。肿瘤患者癌旁组织H.pylori阳性率高于肿瘤组织,差异有统计学意义(p<0.001)。应用Logistic回归模型排除混杂因素,结果表明H.pylori是喉癌的危险因素[OR=8.12,95%置信区间：(3.07,21.53),p<0.001]。但通过ELISA检测,结果显示两组人群的差异没有统计学意义(77.8%vs.76.0%,p=0.79)。本部分研究通过nPCR发现H.pylori定植于喉黏膜,H.pylori感染与喉鳞癌存在相关性。推测该菌可能是喉癌的危险因素,喉黏膜可能是H.pylori的贮存部位和传播的途径之一。第二部分,H.pylori诱导MSH2与MLH1基因表达改变在喉鳞癌中的机制研究。分析MSH2与MLH1在喉癌中的表达水平以及与生存函数的关系,探讨定植于喉部的H.pylori是否诱导MSH2与MLH1的表达改变。收集两组人群的组织样本与病例资料。采用RealtimePCR和Westernblotting检测第一组人群,21例喉鳞癌患者的MSH2与MLH1的mRNA与蛋白的表达水平。回顾性分析第二组人群180例喉鳞癌患者的的生存函数,同时采用组织芯片技术(Tissuemicroarray,TMA)联合免疫组化分析MSH2与MLH1表达水平。建立感染模型,研究H.pylori是否诱导MSH2与MLH1的表达改变。结果显示第一组人群的MSH2与MLH1的表达水平在肿瘤组织低于癌旁正常组织(p<0.001)。回顾性分析第二组喉癌患者的生存函数,结果表明MSH2与MLH1的表达水平与生存率相关,表达阴性患者生存时间低于阳性患者(MSH2：HR=4.38,95%置信区间：1.05-18.25；p=0.04；MLH1：HR=3.0,95%置信区间：1.76-5.14；p<0.001)。采用H.pylori标准菌株干扰喉癌细胞株HEp-2和AMC-HN-8,检测在不同细菌干扰量及不同时间点的MSH2与MLH1的表达水平,结果显示H.pylori可以明显降低MSH2与MLH1的表达水平(p<0.05)。本部分研究揭示了喉鳞癌患者的肿瘤组织中MSH2与MLH1表达水平下调,表达阴性的喉鳞癌患者的生存时间降低。推测定植于喉部的H.pylori可能诱导MSH2与MLH1的表达降低而参与喉癌的发生。第三部分,喉黏膜微生物的生态结构及其与喉鳞癌的动态差异性的研究。分析喉黏膜部位微生物菌群整体的结构特征,以及正常人群与喉鳞癌患者的菌群结构的差异性。收集40例喉鳞癌患者与31例声带息肉的拭子样本,同时收集对应的组织样本。采用454GenomeSequencerFLXTitaniumplatform高通量测序,共检测到14个门218个属的菌群。正常人群中,喉部主要的菌群在门水平主要包括：Firmicutes门(59.0%),Proteobacteria门(10.8%),Bacteroidetes门(10.4%),Fusobacteria门(10.1%),Actinobacteria门(10.0%).喉鳞癌患者中,在门水平主要的菌群为：Firmicutes门(52.5%),Fusobacteria门(16.2%),Bacteroidetes(16.5%),Proteobacteria门(11.0%),Actinobacteria门(5.5%).结果显示会厌附近与喉部声门上至声门下的菌群结构存在明显差异性(p<0.001)。喉鳞癌患者的菌群结构和正常人群的分布存在明显的差异性(p=0.006),部分微生物可能与喉鳞癌存在相关性(p<0.05)。本部分研究首次揭示了喉黏膜菌群的生态结构,推测Peptostreptococcus属,Prevotel1a属,Parvimonas属,Streptococcus属,Granulicatella属和螺杆菌属等部分菌群是喉癌的危险因素或保护性因素,这些菌群相互作用与制衡,动态的调节喉部微生态环境的平衡,当菌群结构失代偿,则可能导致肿瘤产生。
【作者】龚洪立；
【导师】周梁；
【作者基本信息】复旦大学，耳鼻咽喉科学，2013，博士
【关键词】喉鳞状细胞癌；幽门螺杆菌；MSH2；MLH1；微生物组学；

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