miRNA-338通过NRP1抑制胃癌的生长、增殖、侵袭转移及上皮间充质转化

【摘要】目的：NRP1作为一种非酪氨酸激酶受体，在胃癌的发生发展中有着重要的作用。而miRNA则是一种普遍存在于生物内的调控基因，和很多疾病，尤其是肿瘤，有着密切的关系。目前尚不知道调节NRP1的上游miRNA，因此本文的目的主要是找出NRP1的上游miRNA，并研究其在胃癌生长、增殖、凋亡及侵袭转移中的作用。方法：1.通过基因芯片技术及生物预测软件，预测出NRP1的上游miRNA。2.通过荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测了该miRNA在5种胃癌细胞株(SGC7901,HGC27,AGS,MKN45及N87)和正常胃粘膜细胞株GES1中的表达，以及41例胃癌组织和24例癌旁组织中该miRNA的表达。3.构建野生型的NRP1PsicheckTM-2载体及定点突变后的NRP1PsicheckTM-2载体，并和miRNAmimics一起通过脂质体共转染，转染18小时后行双荧光素酶检验。4.构建该miRNA的慢病毒载体并将其感染至胃癌细胞株AGS及MKN45中，并通过MTT、平板克隆实验、transwell小室侵袭实验及流式细胞仪检测AGS及MKN45中生长、凋亡及侵袭转移能力；进行NPR1过表达补救实验，即构建缺少3’UTR端的NRP1过表达载体，将其与该miRNA分别转染至AGS细胞株中，把实验分为四种①对照组②NRP1过表达组③miRNA过表达组④miRNA过表达NRP1过表达组，分别检测其生长、凋亡及侵袭转移能力。5将过表达该miRNA的胃癌稳定细胞株AGS或过表达NRP1的胃癌稳定细胞株AGS注入裸鼠皮下，观察裸鼠胃癌移植瘤的生长情况。6.通过Westernblot法检测过表达该miRNA后，磷酸化ERK1/2,Akt及P38MAPK表达水平的变化，并同样进行上述的补救实验。7.构建NRP1小干扰质粒SiNRP1，并通过Westernblot检测NRP1干扰后AGS细胞中上皮细胞标志物（E-cadherin蛋白）和间叶细胞标志物（fibronectin,vimentin,N-cadherin和SNAIL蛋白）的表达情况；检测过表达该miRNA或NRP1后，AGS细胞中上皮和间叶细胞标志物的表达情况。结果：1.通过基因芯片技术及生物预测软件，预测出NRP1的上游miRNA为miR-338。2.qRT-PCR结果表明，miR-338在5种胃癌细胞株中的表达较正常胃粘膜细胞明显降低(p<0.05)，miR-338在41例胃癌组织中的表达也较24例癌旁组织明显降低(p<0.05)。3.双荧光素酶检验结果显示miR-338能明显抑制野生型NRP1PsicheckTM-2载体的荧光强度(p<0.05)，而无法抑制突变后NRP1PsicheckTM-2载体的荧光强度(p>0.05)，说明NRP1为miR-338的下游靶基因。4.MTT、平板克隆实验、transwell小室侵袭实验及流式细胞仪检测结果表明，过表达miR-338组中胃癌细胞株AGS及MKN45的生长、增殖及侵袭转移能力较对照组明显降低(p<0.05)，凋亡水平较对照组明显增加(p<0.05)；补救实验证明，过表达NRP1能恢复过表达miR-338胃癌细胞的生长、增殖、凋亡及侵袭转移能力，说明miR-338是通过抑制NRP1的表达来抑制胃癌生长的。5.过表达miR-338组中裸鼠胃癌移植瘤大小较对照组明显减少(p<0.05)；过表达NRP1及miR-338后的裸鼠胃癌移植瘤大小与对照组基本一致，说明miR-338是通过抑制NRP1的表达来抑制裸鼠移植瘤生长的。6.Westernblot检测结果表明，过表达miR-338组中磷酸化ERK1/2,Akt及P38MAPK的表达较对照组明显减少(p<0.05)，补救实验证明，过表达NRP1能恢复过表达miR-338组中磷酸化ERK1/2,Akt及P38MAPK的表达水平，说明miR-338是通过抑制NRP1的表达来调节相关信号通路的。7.Westernblot检测结果表明，NRP1干扰组E-cadherin蛋白表达较对照组明显增加(p<0.05)，fibronectin,vimentin,N-cadherin和SNAIL蛋白较对照组明显减少(p<0.05)，说明NRP1能调节胃癌的上皮间充质转化进程；过表达miR-338组中，E-cadherin蛋白表达较对照组明显增加(p<0.05)，fibronectin,vimentin,N-cadherin和SNAIL蛋白较对照组明显减少(p<0.05)，说明miR-338和siNRP1一样，可以抑制胃癌的上皮间充质转化进程；过表达NRP1能恢复过表达miR-338胃癌细胞中的上皮间叶细胞标志物，说明miR-338是通过NRP1来调节胃癌上皮间充质转化进程的。结论：miR-338作为一种抑癌基因，在胃癌中低表达。而过表达的miR-338可以通过抑制NRP1的表达，经ERK1/2,Akt及P38MAPK通路，来抑制胃癌的生长、增殖、侵袭转移及胃癌的上皮间充质转化。
【作者】彭阳；
【导师】吴小翎；
【作者基本信息】重庆医科大学，消化内科，2014，博士
【关键词】胃癌；神经纤毛蛋白1；微小RNA；上皮间充质转化；

【参考文献】
[1]张亚萍.基于课例研究的教师PCK的发展研究[D].华东师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[2]张伟.预应力锚固技术在沿空巷道中的应用研究[D].西安科技大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[3]刘梅.华兹华斯与谢灵运山水诗之比较研究[D].淮北师范大学,文艺学,2014,硕士.
[4]律国黎.制药行业挥发性有机物（VOCs）污染特性研究[D].河北科技大学,环境科学与工程,2013,硕士.
[5]刘丽娟.人性视野之我国刑事无因回避制度的建构[D].华中师范大学,诉讼法学,2013,硕士.
[6]秦化淑,梅生伟.一类非线性时变不确定系统的镇定[J].控制与决策,1996,04:500.
[7]周腾.数据挖掘:数据仓库构架的拓展[J].电脑与信息技术,2001,02:54-57.
[8]贺石良.黑龙江省嫩江县“节水增粮行动”水资源保障方案研究[D].吉林大学,水利工程,2014,硕士.
[9]刘德定.邓小平的社会主义本质观研究[D].河南大学,马克思主义理论与思想政治教育,2004,硕士.
[10]程妍.休谟“同情”理论思想研究[D].吉林大学,马克思主义哲学,2013,硕士.
[11]许英君.弥漫大B细胞淋巴瘤合并噬血细胞综合征个案报道及文献综述[D].郑州大学,肿瘤学（专业学位）,2013,硕士.
[12]王琪.卡前列素氨丁三醇诱导小鼠离体痛经模型的建立与间苯三酚解痉机制的研究[D].湖北中医药大学,药剂学,2013,硕士.
[13]赵吉祥.基于VIIS-EM的时频域测试技术研究[D].吉林大学,电工理论与新技术,2013,硕士.
[14]林森.粘滞阻尼器对刚度偏心结构扭转效应影响的参数研究[D].中南林业科技大学,结构工程,2014,硕士.
[15]褚晓岚.土地信访的原因及对策研究[D].南京农业大学,公共管理,2013,硕士.
[16]马合峰.基于体布拉格光栅和碳纳米管的掺Tm激光器研究[D].中国科学院研究生院（西安光学精密机械研究所）,光学,2013,硕士.
[17]黄艳.法律英语术语汉译的原则与方法[D].湖南师范大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[18]赵蕊.基于WEKA平台的决策树算法设计与实现[D].中南大学,2007.
[19]张金宝.我国交通基础设施融资租赁信用风险评价研究[D].燕山大学,区域经济学,2014,硕士.
[20]胡卫杰.镁合金车轮弯曲疲劳寿命预测及动态特性分析[D].燕山大学,工程力学,2014,硕士.
[21]王万良,王磊,王海燕,徐新黎,赵燕伟.基于混合差分进化算法的作业车间动态调度[J].计算机集成制造系统,2012,03:531-539.
[22]厉广辉.花生抗旱性状鉴定及不同品种抗旱的生理机制研究[D].山东农业大学,作物栽培学与耕作学,2014,博士.
[23]李倩.S100A8和S100A9在脑缺血再灌注损伤中的表达及其意义[D].华中科技大学,急诊医学,2013,硕士.
[24]郝哲.IGF-Ⅰ及受体基因mRNA在不同发育时期鹅肌肉组织中表达的研究[D].吉林农业大学,动物遗传育种与繁殖,2012,硕士.
[25]葛坤坤.两种方法治疗股骨干骨折骨不连临床疗效比较[D].山西医科大学,骨科学（专业学位）,2013,硕士.
[26]梁秀婷.高中古诗词文化常识教学研究[D].东北师范大学,课程与教学论,2012,硕士.
[27]徐婧,朱永法.对“氧化石墨烯对水中内分泌干扰物双酚A的吸附性能”评论的回复[J].物理化学学报,2014,07:1392.
[28]吕雅菲.北京市发展低碳经济的问题与对策研究[D].首都经济贸易大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[29]白成英.高温除尘用复合碳化硅多孔陶瓷制备及性能研究[D].海南大学,材料物理与化学,2014,硕士.
[30]胡亮亮,唐建军,张剑,任伟征,郭梁,MatthiasHalwart,李可心,朱泽闻,钱银龙,吴敏芳,陈欣.稻-鱼系统的发展与未来思考[J].中国生态农业学报,2015,03:268-275.
[31]姬锐锐.城市雨洪生态化控制体系研究[D].长安大学,市政工程,2013,硕士.
[32]卓剑伟.异质信念与中国股市反转效应[D].华中科技大学,金融学,2012,硕士.
[33]李智.“德智和谐”教育观念在高职院校教学实践中的应用研究[D].河北师范大学,教育学原理,2012,硕士.
[34]赵芳.高中历史探究式教学初探[D].华中师范大学,学科教学,2013,硕士.
[35]刘晓利.铁钻工旋扣机构研究与动力学分析[D].吉林大学,机械电子工程,2014,硕士.
[36]张蕾,何小荣,陈丙珍.常减压装置生产数据的聚类分析[J].计算机与应用化学,2003,Z1:143-147.
[37]唐清泉,罗党论,王莉.大股东的隧道挖掘与制衡力量——来自中国市场的经验证据[J].中国会计评论,2005,01:63-86.
[38]吕晓云.分布式系统局域网络技术在太钢生产过程控制中的应用[J].冶金自动化,1997,02:23-27.
[39]邱鹏凯.压电纤维复合材料有效电弹性模量研究[D].燕山大学,工程力学,2014,硕士.
[40]高飞.财政分权的立宪研究[D].安徽大学,法学理论,2013,硕士.
[41]蔡飞,宋永昌.武夷山木荷种群结构和动态的研究[J].植物生态学报,1997,02:43-53.
[42]任霑.传统荣辱观与当代中国公民价值取向[D].青海师范大学,中国哲学,2012,硕士.
[43]秦虎.枣庄市文化产业发展中的政府作用研究[D].山东师范大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[44]肖宜安,何平,李晓红.濒危植物长柄双花木的花部综合特征与繁育系统[J].植物生态学报,2004,03:333-340.
[45]杨虹.微生物脱盐燃料电池与电容法除盐技术耦合工艺的研究[D].哈尔滨工业大学,环境科学与工程,2013,硕士.
[46]李涛.两级轴流血泵结构设计与性能仿真[D].武汉科技大学,机械电子工程,2012,硕士.
[47]谢廖莎.《园冶》中的设计美学思想研究[D].山东大学,艺术学,2013,硕士.
[48]吴艳.融资型中小企业俱乐部方案设计[D].中南林学院,林业经济管理,2004,硕士.
[49]李俊阳.基于三方博弈的中国铁路运力资源优化配置研究[D].北京交通大学,2014.
[50]刘旺盛,杨帆,李茂青,陈培芝.需求可拆分车辆路径问题的聚类求解算法[J].控制与决策,2012,04:535-541.