气道酸性微环境对气道上皮紧密连接的影响及其分子机制

【摘要】目的：研究诸多肺部慢性炎症性疾病状态下气道酸性微环境对气道上皮紧密连接（TightJunction,TJ）形成的影响，探讨其中的分子链接机制。从而为理解病理状态下，酸性气道微环境对气道上皮物理屏障功能的影响；诠释其中的分子机制，提供理论基础。方法：（1）明确酸性刺激对气道上皮细胞TJ的影响体外培养永生化人支气管上皮细胞株（16HBE），使用WesternBlot法检测气道上皮主要紧密连接蛋白的表达情况。使用不同酸度的培养基刺激模拟病理状态下气道酸性微环境，使用跨皮细胞组抗仪检测气道上皮细胞层的跨皮细胞阻抗（Trans-epitheliumelectricalresistant,TER），运用辣根过氧化物酶（HorseRadishPeroxidase,HRP）流量法反应上皮细胞的通透性；通过WesternBlot法检测细胞TJ蛋白家族总量的变化情况，通过细胞免疫荧光技术检测气道上皮TJ蛋白家族的细胞分布情况。（2）明确酸性刺激下，气道上皮物理屏障/通透属性平衡态失调的分子链接机制构建瞬态电压感受器阳离子通道V1（transientreceptorpotentialcationchannelsubfamilyVmember1,TRPV1）短发夹RNA（shorthairpinRNA,shRNA），通过转染筛选TRPV1缺陷的16HBE细胞株；运用TRPV1抑制剂capsazepine，细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM，PKC抑制剂Safingol，Calpain蛋白酶抑制剂MDL28170等信号通路节点阻断剂进行干预，探讨酸性微环境影响人气道上皮TJs的信号转导机制。结果：（1）酸性微环境诱导气道上皮细胞株16HBE物理屏障功能减退，并在一定范围内呈时间-浓度依赖性使用不同浓度的酸性培养基可影响人气道上皮细胞层的TER。pH6.0酸性刺激可轻微增高气道上皮细胞TER值，但无统计学差异；pH低于6.0的酸性培养基刺激可导致气道上皮细胞系（16HBE）TER值的下降，并呈时间、浓度依赖性。pH5.0的酸性培养基刺激8h，可使16HBE细胞层的TER值下降约61.0±6.6%；pH4.0的酸性培养基刺激8h，可使16HBE细胞TER值下降约52.9±6.7%。运用HRP流量法检测酸性刺激下16HBE细胞层的通透性变化，16HBE细胞通透性依赖于酸性刺激的强度与时间，在pH5.0的酸性刺激下，16HBE细胞通透性开始出现升高。pH5.0的酸性培养基刺激8h，可使16HBE细胞层HRP流量值增为对照组的（4.1±0.4）倍，pH4.0刺激可诱导HRP流量值增为对照组的（4.9±0.5）倍。（2）酸性微环境诱导气道上皮细胞株16HBE中Claudin-3、Claudin-4胞膜锚定蛋白部分降解使用WesternBlot法检测气道上皮细胞16HBE膜提取物中TJ蛋白家族在酸性刺激下的表达量发现，酸化培养基（pH5.0）可明显下调细胞内Claudin-3与Claudin-4的表达，但不影响气道上皮TJ蛋白家族成员Occludin、Claudin-1、Claudin-5、Claudin-7及ZO-1的表达量。进一步使用细胞免疫荧光共聚焦法显示在酸化培养液刺激下，16HBE细胞衔接处Claudin-3、Claudin-4量显著降低。（3）酸性微环境诱导气道上皮细胞株16HBE中Claudin-3、Claudin-4胞膜锚定蛋白部分降解及物理屏障/通透属性失调可能通过TRPV1-[Ca2+]i-PKCα信号链激活Calpain蛋白酶系统所实现使用TRPV1特异性shRNA下调TRPV1的表达，构建TRPV1缺陷的16HBE细胞株；分别运用TRPV1离子通道抑制剂capsazepine，细胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM、PKC选择性抑制剂Safingol或使用需钙蛋白酶calpain抑制剂MDL28170预处理16HBE细胞，通过阻断TRPV1-[Ca2+]i-PKC-Calpain信号链可部分抑制酸性刺激下膜锚定蛋白Claudin-3，Claudin-4的降解与重分布，减轻酸性培养下16HBE细胞层TER值的下降与通透性的升高。结论：（1）酸性气道微环境可通过诱导气道上皮细胞TJ蛋白家族Claudin-3及Claudin-4的改变，引起气道上皮细胞物理屏障/通透属性平衡态失调。（2）酸性刺激主要为通过TRPV1-[Ca2+]i-PKC信号链激活钙调蛋白酶Calpain，诱导细胞间连接处Claudin-3、Claudin-4的降解，从而引起气道粘膜物理屏障功能减损。
【作者】许瑞；
【导师】周向东；
【作者基本信息】重庆医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】酸性；气道上皮；紧密连接；

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