PCSK9在动脉粥样硬化形成中的作用及机制研究

【摘要】枯草溶菌素转化酶9（proproteinconvrtasesubtilisin/kexin9，PCSK9）是2003年发现的一个脂质代谢调节蛋白，属于前蛋白酶家族中的第九个成员。研究表明PCSK9可通过促进肝细胞的低密度脂蛋白受体(lowdensitylipoproteinreceptor,LDLR)降解，调节肝脏脂质代谢，影响血浆LDL-C水平。PCSK9已经成为降脂药物研发及动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)干预的热门靶点。目前研究主要是阐明了PCSK9通过调节肝脏脂质代谢从而影响血脂，间接参与As发生。但是，有研究认为除了影响血液LDL-C水平之外，PCSK9对血管壁的直接作用在As发生发展中亦发挥重要影响。因此有必要阐明PCSK9在血管壁如何直接参与As发生及其机制，为揭示PCSK9在As发病中的作用及机制提供新观点，并为确立PCSK9作为As治疗新靶点提供更充分的科学依据。血管壁巨噬细胞的脂质蓄积及炎症反应作为As发生发展中的关键环节已得到广泛认同，抑制巨噬细胞脂质蓄积和炎症反应是干预As形成的一个重要方向。巨噬细胞主要是通过清道夫受体途径荷脂，这种方式不受细胞内胆固醇浓度的负反馈调节，因此可无限制地摄入ox-LDL并沉积在胞内，导致泡沫细胞的形成，进而促进As斑块的发展。但PCSK9在巨噬细胞脂质代谢中的作用及机制尚待阐明。2010年LanH等通过基因微阵列分析研究发现炎症和应激反应途径可能受PCSK9的调控。而我们的前期工作发现在冠心病患者血浆中PCSK9水平与IL-6、TNF-α水平均呈正相关。巨噬细胞作为动脉粥样硬化斑块中的主要炎症细胞，可分泌大量的炎性因子、趋化因子和基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMP)，从而导致斑块的不稳定性，加速斑块的破裂。但PCSK9是否参与巨噬细胞的炎症因子分泌目前尚不清楚。因此，本研究提出“PCSK9通过参与巨噬细胞的脂质蓄积和炎症因子分泌而促进As发生发展”的科学假设。为回答这一科学问题，在第一部分研究中检测了PCSK9在As斑块中的表达情况以及是否与巨噬细胞共定位，并观察了氧化低密度脂蛋白（Oxidizedlow-densitylipoprotein，oxLDL）对巨噬细胞PCSK9表达的影响；在第二部分研究中，通过构建PCSK9过表达慢病毒载体和PCSK9-shRNA慢病毒载体，上调或抑制巨噬细胞PCSK9表达，观察PCSK9表达改变对巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌的影响，并探索此过程中脂质代谢及炎症反应相关基因表达的变化；在第三部分研究中，采用ApoE-/-小鼠，通过尾静脉注射PCSK9-shRNA慢病毒载体，并高脂喂养复制As动物模型，在此基础上观察了PCSK9-shRNA对ApoE-/-小鼠As病变及其斑块脂质蓄积和局部炎症的影响，并探讨了CD36和TLR4/NF-κB信号通路在此过程中的作用。第一部分PCSK9在As斑块巨噬细胞中的表达及oxLDL对巨噬细胞PCSK9表达的影响目的：明确PCSK9在As斑块中是否表达及与巨噬细胞共定位情况；分析oxLDL对巨噬细胞PCSK9表达的影响。方法：取尸检的人As斑块以及ApoE-/-小鼠As斑块，采用免疫组织化学法检测斑块中PCSK9的表达，免疫荧光双标技术检测PCSK9在斑块中与巨噬细胞共定位情况；培养人THP-1巨噬细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞，采用免疫荧光细胞化学方法检测PCSK9在两种巨噬细胞中的表达情况；最后，用不同浓度ox-LDL处理两种巨噬细胞不同时间，实时定量PCR和Westernblotting检测细胞PCSK9mRNA及蛋白质的表达。结果：免疫组织化学检测结果显示As斑块中PCSK9呈阳性表达，阳性染色的区域主要分布在斑块增生的内膜中，而在正常主动脉中未见PCSK9明显表达；免疫荧光双标技术检测结果显示As斑块中PCSK9阳性表达区域与巨噬细胞特异性抗原CD68阳性表达区域基本一致；免疫荧光细胞化学方法检测结果显示，PCSK9在人THP-1巨噬细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞均阳性表达，呈红色荧光，主要分布在细胞胞浆中；实时定量PCR和Westernblotting结果显示，oxLDL呈浓度依赖性上调两种巨噬细胞PCSK9mRNA和蛋白质表达，而50μg/mloxLDL分别处理巨噬细胞不同时间后，PCSK9mRNA和蛋白质表达也上调，呈时间依赖性。小结：①PCSK9在As斑块中存在表达且与巨噬细胞共定位；②巨噬细胞中存在PCSK9表达，oxLDL呈浓度和时间依赖性上调巨噬细胞中PCSK9表达。第二部分PCSK9对oxLDL诱导的巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌的影响及机制目的：观察PCSK9表达改变对oxLDL诱导的巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌的影响及其调控分子机制。方法：1.根据设计的PCSK9基因RNA干扰靶序列，合成靶序列的双链DNA，接入GV115慢病毒载体，构建PCSK9-shRNA慢病毒载体；利用PCR方法获得小鼠PCSK9基因，并将其连接入GV287慢病毒载体，构建PCSK9过表达慢病毒载体；采用菌落PCR和DNA测序对构建的载体进行鉴定后，分别与pHelper1.0载体和pHelper2.0载体共同转染293T细胞，包装产生慢病毒颗粒，采用荧光法或实时定量PCR测定病毒滴度；两种慢病毒颗粒分别感染体外培养的小鼠RAW264.7巨噬细胞，实时定量PCR和/或Westernblotting检测细胞PCSK9表达。2.以PCSK9-shRNA慢病毒载体、PCSK9过表达慢病毒载体和/或oxLDL处理RAW264.7巨噬细胞，油红O染色、Filipin染色法检测巨噬细胞胆固醇蓄积，ELISA检测细胞炎症因子分泌。3.以PCSK9-shRNA慢病毒载体、PCSK9过表达慢病毒载体分别转染RAW264.7巨噬细胞，加或不加oxLDL处理，采用实时定量PCR或Westernblotting检测巨噬细胞清道夫受体CD36、SR-AI、SR-BI和炎症反应相关基因TLR4表达以及NF-κB活性。结果：1.菌落PCR和DNA测序证实，PCSK9-shRNA慢病毒载体和PCSK9过表达慢病毒载体构建正确，病毒滴度分别为5.0×108TU/ml和2.0×108TU/ml；实时定量PCR和/或Westernblotting结果显示，PCSK9-shRNA慢病毒明显抑制了RAW264.7巨噬细胞PCSK9表达，而PCSK9过表达慢病毒大幅度增加了RAW264.7巨噬细胞PCSK9表达。2.油红O染色和Filipin染色结果显示，与oxLDL单独处理组相比，PCSK9低表达组细胞内胆固醇蓄积明显减少，而PCSK9过表达组细胞内胆固醇蓄积则明显增多；ELISA检测结果显示PCSK9低表达能抑制oxLDL诱导的RAW264.巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1分泌，而PCSK9过表达能促进oxLDL诱导的RAW264.巨噬细胞炎症因子分泌。3.实时定量PCR结果显示，PCSK9低表达或过表达对巨噬细胞SR-AI、SR-BImRNA表达均无影响，而CD36和TLR4mRNA表达在PCSK9干扰时下调，在PCSK9过表达时上调；Westernblotting结果显示，PCSK9低表达及过表达对oxLDL诱导的RAW264.巨噬细胞SR-AI和SR-BI蛋白质表达的改变无明显的影响，但PCSK9低表达能抑制oxLDL诱导的RAW264.巨噬细胞CD36、TLR4蛋白质表达的上调，而PCSK9过表达能加剧这一效应，结果还显示，PCSK9低表达可以抑制oxLDL诱导的巨噬细胞p-IkBα表达上调、IkBα的降解以及NF-κB核转位，而PCSK9过表达的作用则与其相反。小结：①成功构建PCSK9过表达和干扰慢病毒载体；②PCSK9高表达能促进巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌，PCSK9低表达则起抑制作用；③PCSK9促进巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌与其上调CD36表达以及激活TLR4/NF-κB信号通路有关。第三部分LV-PCSK9shRNA对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块脂质蓄积和局部炎症因子表达的影响及机制研究目的：探索LV-PCSK9shRNA对ApoE-/-小鼠As斑块脂质蓄积和局部炎症因子表达的影响及其机制。方法：6周龄雄性ApoE-/-小鼠30只适应性喂养1周后，随机分为两组：对照组、LV-PCSK9shRNA组，每组15只，其中LV-PCSK9shRNA组通过尾静脉注射LV-PCSK9shRNA，每只鼠注射量为4×107TU/次，每6周一次。两组小鼠予以高脂喂养，12周后处死动物，采用荧光显微镜观察LV-PCSK9shRNA转染情况；分别采用免疫组织化学法、实时定量PCR及Westernblotting检测主动脉PCSK9基因表达情况；全自动生化分析仪检测各组小鼠血脂水平；体视显微镜下观察、苏丹Ⅳ染色及HE染色检测主动脉粥样硬化病变面积；油红O染色、Masson染色以及Filipin染色三种方法检测主动脉窦As病变处脂质蓄积的情况；免疫荧光和免疫组织化学法检测斑块巨噬细胞浸润情况；实时定量PCR和免疫组织化学法检测主动脉TNF-α、IL-1β和MCP-1的表达；免疫组织化学或荧光法、实时定量PCR和Westernblotting检测主动脉CD36、TLR4及NF-κB的表达。结果：荧光显微镜观察显示主动脉存在GFP表达；LV-PCSK9shRNA成功敲减了ApoE-/-小鼠主动脉中PCSK9基因的表达；与对照组相比，LV-PCSK9shRNA组ApoE-/-小鼠血脂水平无明显改变，但主动脉粥样硬化病变面积明显减少；油红O染色、Masson染色以及Filipin染色分析结果显示LV-PCSK9shRNA可减少ApoE-/-小鼠主动脉窦As病变处脂质蓄积；与对照组相比，LV-PCSK9shRNA组主动脉炎症因子TNF-α、IL-1β和MCP-1mRNA的表达以及主动脉窦As斑块处TNF-α、IL-1β和MCP-1蛋白质的分泌减少，并且主动脉窦As斑块中巨噬细胞浸润减少，而免疫组织化学法、实时定量PCR和Westernblotting结果显示该组小鼠主动脉中CD36、TLR4表达降低、NF-κB核转位减少且活性降低。小结：抑制PCSK9表达对ApoE-/-小鼠血脂水平无明显影响，但仍能够通过减少As斑块脂质蓄积和局部炎症因子表达这一新作用途径抑制小鼠As病变形成，其机制可能与下调小鼠主动脉CD36、TLR4的表达以及降低NF-κB的活性有关。
【作者】唐志晗；
【导师】姜志胜；
【作者基本信息】南华大学，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】巨噬细胞；oxLDL；慢病毒载体；ApoE；鼠主动脉；PCSK9；斑块面积；RAW；炎症因子；脂质代谢；

【参考文献】
[1]孙颖,丁佳丽,宗皓,王健丹,吕晓迎.白蛋白和石墨烯的结构及其相互作用的分子动力学模拟[J].东南大学学报(自然科学版),2014,01:123-128.
[2]王梦媛.对高师舞台声乐实践课的研究[D].云南师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[3]杨炳儒,李岩,郑川.WWW上智能信息搜索技术研究[J].系统工程与电子技术,2003,07:856-859.
[4]李金平.基于Price-Mueller（2000）模型的技术人才离职问题分析及对策研究[D].北京交通大学,2014.
[5]高智,徐政.数据挖掘技术在电力系统中的应用[J].华东电力,2001,12:4-7+73.
[6]王德馨.中药渣发酵生产微生物絮凝剂的研究[D].北京中医药大学,微生物与生化药学,2013,硕士.
[7]王晓俏.CRP促血管内皮功能障碍及短期强化阿托伐他汀治疗的效应及机制研究[D].南方医科大学,麻醉学,2014,博士.
[8]夏文学.中外二语教学实验研究比较分析[D].华中师范大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[9]王希文.不同针刺方法治疗脊髓疾病继发神经病理性疼痛的临床疗效观察[D].黑龙江中医药大学,中医学（专业学位）,2013,硕士.
[10]宋擒豹,沈钧毅.基于关联规则的Web文档聚类算法[J].软件学报,2002,03:417-423.
[11]胡应交,王松涛.吸附式低反动度轴流压气机气动设计思想在多级轴流压气机中的应用[J].航空动力学报,2014,11:2550-2560.
[12]李冬花.g-C_3N_4及其复合材料的制备及光降解性能的研究[D].山西大学,2013.
[13]赵倩.挂于腰间的金色文化甘肃保安族腰刀多元一体设计文化探析[D].重庆大学,设计学,2014,硕士.
[14]李辉.曼月乐与口服药物治疗子宫腺肌病疗效的meta分析[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[15]李宝东.中国银行银信合作发展策略研究[D].哈尔滨工业大学,高级管理人员工商管理,2013,硕士.
[16]姜勇.印染废水处理设施综合评价指标体系和评价方法的研究[D].华中科技大学,市政工程,2013,硕士.
[17]白玉渊.厦门市政府投资建设项目管理模式改革与探索[D].重庆大学,建筑与土木工程,2003,硕士.
[18]李怡庭,高俊杰.提高监测水平保障供水安全做好新时期水质监测工作[J].中国水利.2004(01)
[19]孟莉.基于商业生态理论的小米手机发展策略研究[D].天津大学,工商管理,2013,硕士.
[20]曹虎.山东滨州灌溉渠道及其环境景观设计研究[D].苏州大学,园林植物与观赏园艺,2013,硕士.
[21]周俊奇.无线网络中的移动台位置估计技术研究[D].南京邮电大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[22]王颖.关于我国乡镇政府改革的研究[D].西北大学,行政管理,2014,硕士.
[23]谢爱民.论鄱阳湖生态经济区水资源行政管理体制的法律规制[D].南昌大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[24]张云龙.冻土区铁路路基GPS一机多天线远程监测系统的研究与设计[D].北京交通大学,交通运输工程（专业学位）,2013,硕士.
[25]张淑艳.社会工作视角下医护人员职业倦怠研究[D].吉林大学,社会工作,2014,硕士.
[26]曲伟.中国电力行业的专利信息分析研究[J].图书情报工作,2014,S1:167-170.
[27]丁一.基于Web挖掘的个性化推荐服务研究[D].华中科技大学,2004.
[28]朱影.煤焦油轻质组分的分离与分析[D].中国矿业大学,化学工程与技术,2014,硕士.
[29]秦宁.小组工作在农村独居老人互助网络建构中的应用[D].华中科技大学,社会工作,2013,硕士.
[30]胡晓舒.我国农业生产污染防治法律制度研究[D].海南大学,环境与资源保护法学,2012,硕士.
[31]肖熠.多小区环境下的波束成形方案研究与分析[D].内蒙古大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[32]陈惠敏,高群,金佐尧.南翔自动化驼峰设备的开发与维修管理[J].铁道通信信号.2001(02)
[33]田丽敏.吉非替尼耐药细胞株NCI-H1975/Gefitinib Resistance的建立及耐药机制初探[D].大连医科大学,病理学与病理生理学,2012,硕士.
[34]郑舫.范围副词“单”和“单单”比较研究[D].华中师范大学,汉语言文字学,2014,硕士.
[35]宁东升.无线多媒体传感器网络设计与实现[D].浙江工商大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[36]郝江叶.腺苷酸环化酶Ⅲ（AC3）在非神经细胞中定位的研究[D].河北大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[37]陈一豪.无铅FCBGA表面贴装回流焊翘曲变形研究[D].华中科技大学,材料加工工程,2013,硕士.
[38]钟贵和.基于灵敏度方法的输电有功运行风险控制[D].广东工业大学,电气工程,2014,硕士.
[39]石华.制造业股权结构与企业非效率投资的关系研究[D].天津财经大学,会计学,2012,硕士.
[40]武剑.柴胡多糖对巨噬细胞免疫功能的调节及对TLR4信号通路的影响[D].复旦大学,药理学,2012,硕士.
[41]谢婉丽.消退素D1对脂多糖诱导的小鼠肺紧密连接蛋白破坏的作用及机制[D].华中科技大学,麻醉科,2013,硕士.
[42]李洋.城市火灾救援应急预案生成中的关键技术研究[D].国防科学技术大学,摄影测量与遥感,2012,硕士.
[43]朱宇婷,毛保华,王永亮,刘路.中长距离通道客流结构及高速铁路运营策略研究[J].交通运输系统工程与信息,2015,01:17-22.
[44]邓晔.基于Web的互动教学平台的设计与实现[D].南昌大学,计算机技术（专业学位）,2012,硕士.
[45]傅春生.一种新的控制系统结构研究及其应用[J].自动化学报,1992,01:107-110.
[46]郭祥俊.我国公共政策的公民参与研究[D].燕山大学,公共管理,2012,硕士.
[47]苏丽娜.杭州疗养院景观调查研究[D].浙江大学,风景园林（专业学位）,2012,硕士.
[48]郑辉,戴启洲,王家德,陈建孟.La-PTFE共掺杂二氧化铅电极的制备及其性能研究[J].环境科学学报,2012,02:282-291.
[49]张弘婧.基于EVA的上市公司财务危机预警模型研究[D].天津财经大学,会计学,2012,硕士.
[50]张羽阳.伊恩·麦克尤恩的《赎罪》中塔利斯姐妹的心理分析[D].河北师范大学,英语语言文学,2013,硕士.