骨不连细胞体外培养及压应力刺激对其成软骨分化影响的研究

【摘要】目的：探讨骨不连瘢痕组织中是否存在一种细胞(NCs),具有间充质干细胞特性以及压应力刺激对NCs成软骨分化的影响。方法：1.骨不连细胞的分离、培养和鉴定收集人的骨不连瘢痕组织,采用组织块培养法并结合传代获取、纯化细胞,观察细胞形态和表面标志物的表达,从而对其鉴定。MTT法测定第3、5、9代细胞的增殖情况。2.骨不连细胞的多分化潜能的研究取生长良好的第3代到第5代的细胞,分别用成骨诱导培养基诱导、成脂诱导培养基及成软骨诱导培养基。于成骨诱导7天,行Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,于诱导14天,Western-blot检测ALP,OC,BSP的蛋白含量,于诱导21天,行茜素红钙结节染色；于成脂诱导14天,行油红O染色,并Western-blot检测LPL,PPARy2的蛋白含量；于成软骨诱导14天后,行番素红染色,并Western-blot检测COLⅡ,COLX,SOX9的蛋白含量。3.压应力对骨不连细胞成软骨分化影响的研究和分子机制探讨收集第三代到第五代细胞,分别给予10KPa,30KPa,50KPa,70KPa压应力刺激,应用MTT法检测细胞的增殖能力。于加压14天后细胞行Q-PCR检测ColⅡ、ColX.SOX9、TGFβ1的mRNA的含量。采用慢病毒载体介导con-shRNA及TGFβ1-shRNA感染NCs细胞,于96h后行GFP免疫荧光检测阳性率,并Western-blot检测TGFβ1表达量。对感染con-shRNA及TGFβ1-shRNANCs的NCs细胞分成三组,一组为感染con-shRNA未加压组,一组为感染TGFβ1-shRNA未加压组,剩余一组为感染TGFβ1-shRNA加压组。于培养后7天收集细胞行P-smad2,Smad2,TGFβ1,ColⅡ、ColX、SOX9蛋白量的表达。结果：1.经组织块培养法结合传代所得到的细胞形态均一,呈长梭形,接近融合状态时可呈现旋涡样生长,传第10代细胞的增殖能力减弱,出现宽大梭形,排列紊乱。90%以上的细胞表达CD29和CD44；小于8.5%的细胞表面表达CD34,CD45.经MTT方法检测,第5代细胞增殖能力最佳。2.骨不连细胞经成骨诱导后,细胞形态开始逐渐发生改变,局部变成多角形,宽大梭形,细胞内颗粒增多,最后成集落层叠生长,于诱导7天时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色阳性,诱导21天茜素红染色阳性,Western-Blot结果显示,高表达ALP,OC及BSP；经成脂诱导后细胞形态由长梭形逐渐变为圆形,短梭形,正方形,不规则形状,呈现“放射状触须”样改变,最后可见细胞内透亮的脂滴形成。于诱导14天油红O染色阳性,Western-Blot结果显示,高表达LPL及PPAR-γ2；经成软骨诱导后细胞形态逐渐变成圆形,椭圆形及多边形。诱导14天番素红染色阳性,Western-Blot结果显示,高表达ColⅡ.ColX和SOX9。3.骨不连细胞给予加压后细胞形态逐渐增大,成宽大形状,细胞分泌物增多,细胞质变得模糊。经MTT检查,细胞增殖能力增强。通过对骨不连干细胞的加压刺激作用,发现软骨细胞分化标志因子ColⅡ.ColⅩ、SOX9,TGFβ1的mRNA表达水平上调,并随着压力增大而上升。采用慢病毒载体介导TGFβ1-shRNA感染NCs细胞,通过GFP荧光检测显示,NCs细胞的慢病毒感染率达80%以上。Westernblot检测TGFβ1表达效率。结果显示,与对照组(Con-shRNA)对比,TGFβ1表达显著抑制,证明慢病毒载体TGFβ1-shRNA能显著下调细胞中TGFβ1的表达。用TGFβ1-shRNA联合压应力处理细胞,发现压应力和TGFβ1-shRNA联合处理细胞后,压应力回复TGFβ1-shRNA对P-Smad2表达的抑制作用。同样回复TGFβ1-shRNA对成软骨细胞标志因子ColⅡ,ColⅩ,SOX9蛋白的抑制作用。结论：1.骨不连细胞NCs属于一种间充质干细胞,具有干细胞的表型及有多向分化能力。2.骨不连细胞NCs经间接压应力刺激后经TGFβ1-Smad2通路向成软骨方向分化。
【作者】唐仲文；
【导师】张湘生；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】骨不连细胞NCs；压应力；成软骨方向；

【参考文献】
[1]寸守辉.针对一组抑郁症疗效数据的线性混合模型[D].云南师范大学,概率论与数理统计,2013,硕士.
[2]朱丹琪,吴成勇.三层次保信息系统安全[J].信息系统工程.2004(06)
[3]熊建萍.汉语发展性阅读障碍儿童的眼动研究[D].天津师范大学,应用心理学,2014,博士.
[4]徐翠.复杂网络中基于数据场的自适应聚类算法研究[D].华中师范大学,计算机系统结构,2014,硕士.
[5]李妍妍.木质陶瓷基凹凸棒石/针铁矿复合材料制备与性能表征研究[D].合肥工业大学,环境工程,2014,硕士.
[6]董淋淋.清入关前与朝鲜间“刷还”问题研究[D].东北师范大学,中国古代史,2012,硕士.
[7]闫种可.基于氧化亚铜纳米线的无酶型传感器研究[D].西南大学,2013.
[8]宫玉梅,宋敬川,夏令明,梁青.嵌段共聚物薄膜中相畴垂直取向的调控[J].高分子通报,2012,09:29-39.
[9]王勇.硝基三唑感度影响的从头算与密度泛函研究[D].中北大学,化学工艺,2013,硕士.
[10]徐妙君,谭小球.商业智能中的数据挖掘研究[J].浙江海洋学院学报(自然科学版),2005,03:88-90.
[11]陈天泽.海外建筑企业财务战略的构建及组织实施[D].首都经济贸易大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[12]邢殿勇,吴绍春,王炜.并行关联规则算法在地震相关性预报中的应用[J].计算机应用研究,2005,10:175-177.
[13]董龙飞.制造业与物流业联动发展模式演变研究[D].长安大学,物流工程（专业学位）,2014,硕士.
[14]王东昊.基于居民地方依恋的婺源古村落旅游资源保护研究[D].江西财经大学,旅游管理,2013,硕士.
[15]缪然.提升目标管理有效性[D].中国科学技术大学,工商管理,2014,硕士.
[16]刘玉娇.烟威地区初中生物学探究性实验教学现状调查及对策研究[D].鲁东大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[17]王欣.1978年后中国当代美术的现代化进程[D].华东师范大学,美术学,2002,硕士.
[18]彭宽.上海失能老人机构护理服务质量控制体系研究[D].上海工程技术大学,社会保障,2014,硕士.
[19]安凤霞.萱草miRNA表达谱构建及低温诱导差异性分析[D].东北农业大学,植物学,2014,博士.
[20]闵春英,聂鹏,刘颖,沈聃,曾名,李娜.耐高温GO/聚酰亚胺复合材料的制备及摩擦性能[J].固体火箭技术,2014,04:569-573.
[21]唐宏德.220kV变电站站用电设计的优化[J].上海电力.2001(03)
[22]赵爱奇.甜瓜α-甘露糖苷酶和β-氨基己糖苷酶基因的克隆及表达分析[D].内蒙古大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[23]杜发荣,吴志新.电动汽车传动系统参数设计和续驶里程研究[J].农业机械学报.2006(11)
[24]张识宇,李大建,杨乃定.基于综合赋权的风险企业增值潜力灰色评价方法[J].控制与决策,2008,10:1122-1128.
[25]甘伟.不同级配常温沥青混合料的性能及应用研究[D].重庆交通大学,道路与铁道工程,2012,硕士.
[26]李雷.NGB-W信道估计算法研究[D].南昌航空大学,控制工程（专业学位）,2013,硕士.
[27]谢春香.常压冷等离子体射流制备荧光碳纳米颗粒[D].湖南科技大学,物理学,2013,硕士.
[28]谢瑞育.1834年前英国东印度公司对华茶叶贸易研究[D].湖南师范大学,世界史,2014,硕士.
[29]白云悦.基于DBSCAN和相似度的子空间聚类算法研究[D].燕山大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[30]孙颖,丁佳丽,宗皓,王健丹,吕晓迎.白蛋白和石墨烯的结构及其相互作用的分子动力学模拟[J].东南大学学报(自然科学版),2014,01:123-128.
[31]刘冬启.观道河水库周丛生物群落结构和渔产潜力的研究[D].华中农业大学,水产养殖,2001,硕士.
[32]连兴华.抗拔桩基承载性能分析[D].哈尔滨工业大学,岩土工程,2013,硕士.
[33]王俊.碳纳米管/量子点纳米复合材料的制备及其性质研究[D].上海师范大学,2010.
[34]郝晓雯.欧美危机的传染机制：纯粹传染还是基本传染？[D].山西财经大学,金融学,2014,硕士.
[35]郝生跃,柴正兴.完善我国建筑安全管理组织体系的思考[J].中国软科学,2006,06:13-19.
[36]武星岑.民营上市公司关联交易的信息披露与治理缺陷[D].北京交通大学,2014.
[37]林映珊.船载镍矿运输法律问题研究[D].大连海事大学,海商法,2014,硕士.
[38]刘晓慧.从音乐课程的三维目标谈我国基础教育音乐师资的培养[D].湖南师范大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[39]张美娟.对外汉语教学中的体态语探析[D].苏州大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[40]本报记者王小伟.石墨烯产业化有望加速“破局”[N].中国证券报,2014-09-02A10.
[41]任晓红.中国电力市场化进程中的政府规制研究[D].重庆大学,产业经济学,2003,硕士.
[42]张莉,高素青.基于数据挖掘技术的IDS简介[J].网络安全技术与应用,2003,04:35-37.
[43]姚念龙,王鸿英.首都大学生政治意识实证分析[J].中国青年研究,2014,01:64-66+73.
[44]王素云.高中男女生数学学习情感及其差异性研究[D].扬州大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[45]邹晓鸥.中国IT企业战略转型探析[D].首都经济贸易大学,教育（专业学位）,2012,硕士.
[46]林莹.藿砂口服液治疗痰湿中阻型功能性消化不良临床疗效观察及对胃电图的影响[D].福建中医药大学,中西医结合临床（专业学位）,2013,硕士.
[47]杨斌,陈绵云.一类具有离散与分布时滞的控制系统的绝对稳定性[J].控制与决策,2001,03:362-364.
[48]吴剑平.牛乳中硫氰酸钠含量检测[D].南京农业大学,兽医,2011,硕士.
[49]陈达.我国竞猜型体育彩票营销组合策略研究[D].北京体育大学,体育人文社会学,2013,硕士.
[50]宣耿珺.休闲服饰行业新媒体营销策略研究[D].兰州理工大学,工商管理,2014,硕士.