视网膜色素变性T17M视紫红质突变诱导细胞死亡的机制研究

【摘要】第一章视紫红质T17M突变体的亚细胞定位目的：研究视紫红质T17M突变体的亚细胞定位及意义。方法：构建pCDNA-3.1-T17Mrhodopsin-myc质粒和pCDNA-3.1-WTrhodopsin-myc质粒,使用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法进行鉴定,基因测序。将构建成功的质粒转染到HEK293细胞,采用Westernblot检测视紫红质T17M突变体和野生型的蛋白表达差异。免疫荧光显微镜下观察视紫红质T17M突变体和野生型的亚细胞定位。结果：经过PCR扩增和双酶切鉴定,获得约1000bp大小的条带,基因测序显示第50位碱基C突变成T,成功构建pCDNA-3.1-T17Mrhodopsin-myc质粒和pCDNA-3.1-WTrhodopsin-myc质粒。质粒转染后,Westernblot检测到约40KD的条带,转染可高效表达视紫红质T17M突变体和野生型蛋白。荧光显微镜检查发现,视紫红质T17突变体聚集在内质网,与高尔基体不存在共定位；而野生型主要位于细胞膜。结论：视紫红质T17M突变体异常定位于内质网,与高尔基体不存在共定位。视紫红质野生型主要位于细胞膜。第二章视紫红质T17M突变体的降解途径目的：研究视紫红质T17M突变体的降解途径及意义。方法：使用MTT法检测视紫红质T17M突变体和野生型的降解速度。Westernblot检测溶酶体抑制剂CQ和蛋白酶体抑制剂MG132对视紫红质T17M突变体和野生型降解的影响。免疫沉淀检测视紫红质泛素化水平。Westernblot检测p97/VCP-QQ(?)ErasinsiRNA对视紫红质T17M突变体和野生型的半衰期的影响。结果：蛋白合成抑制剂CHX处理HEK293细胞和ARPE-19细胞6h后,CHX处理前视紫红质蛋白标化为1,HEK293细胞的视紫红质T17M突变体和野生型蛋白相对值分别为0.219±0.032和0.635±0.072(P<0.01),ARPE-19细胞的视紫红质T17M突变体和野生型蛋白相对值分别为0.302±0.041和0.531±0.052(P<0.01)。溶酶体抑制剂CQ处理HEK293细胞12h后,视紫红质T17M突变体由1增加到1.023±0.265,视紫红质野生型蛋白相对值由1增加到1.433±0.159(P<0.05)。蛋白酶体抑制剂MG132处L理HEK293细胞6h后,视紫红质T17M突变体由1增加到7.213±2.108(P<0.01),视紫红质野生型蛋白相对值由1增加到2.011±0.221(P<0.05)。免疫沉淀后,泛素化视紫红质T17M突变体由1增加到2.200±0.361(P<0.01),野生型蛋白相对值由1增加到1.160±0.162。在ARPE-19细胞中过表达p97/VCP-QQ后,对照组和p97/VCP-QQ组的视紫红质T17M突变体蛋白相对值分别为0.159±0.052和0.558±0.095(P<0.01)。ErasinsiRNA处理后,视紫红质T17M突变体的对照组ErasinsiRNA组的蛋白相对值分别为0.230±0.059和0.602±0.064(P<0.01),而视紫红质野生型降解速度没有明显变化。结论：与视紫红质野生型相比,T17M突变体降解加速。视紫红质T17M突变体只能通过蛋白酶体系统降解,而野生型可以通过自噬溶酶体系统和蛋白酶体系统降解。视紫红质T17M突变体的降解与泛素化的ERAD相关。过表达p97/VCP-QQ和ErasinsiRNA干扰可以抑制视紫红质T17M突变体通过ERAD途径降解。第三章视紫红质T17M突变诱导细胞死亡的机制目的：研究视紫红质T17M突变诱导细胞死亡的机制。方法：建立pEGFP-CL1-ARPE-19细胞系,采用Westernblot方法检测其蛋白酶体活性。过表达视紫红质蛋白,诱导内质网应激反应,采用Westernblot方法检测内质网应激相关蛋白BIP、GRP94、CHOP、peIF-2a、eIF-2a、activeATF-6a的表达差异,并用PBA处理细胞,观察PBA对以上内质网应激相关蛋白表达的影响。Tunicamycin处理ARPE-19细胞,流式细胞仪检测细胞死亡数目。过表达视紫红质T17M突变体,采用流式细胞仪检测细胞内ROS水平,并使用ROS清除剂NAC和BHA处理,观察细胞死亡变化情况。结果：pEGFP-CL1-ARPE-19细胞系可稳定表达uGFP,视紫红质T17M突变、野生型的uGFP表达量没有显著变化。T17M突变可使细胞内质网应激蛋白BIP、GRP94、CHOP、peIF-2a、eIF-2a、activeATF-6a表达上调,与视紫红质野生型相比,BIP、CHOP、GRP94、peIF-2a/eIF-2a、activeATF-6a表达量分别增加2.439±0.363倍(P<0.01)、2.433±0.802倍(P<0.01)、1.600±0.212倍(P<0.05)、1.567±0.153(P<0.05)、2.167±0.306倍(P<0.01)。与视紫红质野生型相比,CHOP表达量在使用PBA处理前后分别增加了2.600±0.854倍和1.467±0.306倍(P<0.05),GRP94表达量处理前后增加1.921±0.557倍和1.203±0.239倍(P<0.05),peIF-2a/eIF-2a为1.733±0.154倍和1.167±0.252倍(P<0.05),activeATF-6a为2.564±0.406倍和1.349±0.529倍(P<0.05)。而使用内质网应激诱导剂‘Tunicamycin前后,空载体、视紫红质野生型和T17M突变体的ARPE-19细胞死亡率分别为4.156%±0.501%和4.814%±0.531%、3.879%±0.413%和5.712%±0.574%、7.021%±0.612%和16.213%±3.419%,视紫红质T17M突变体过表达的细胞死亡率较空载体和野生型明显增加(P<0.05)。与空载体组相比,视紫红质野生型和视紫红质T17M突变体ROS的相对比分别为1.136±0.055,1.935±0.088(P<0.01)。使用ROS清除剂NAC和BHA后,空载体组、DMSO组、NAC组和BHA组的死亡率分别为3.716%±0.523%、7.322%±1.924%、4.857%±1.369%(相比DMSO组,P<0.05)和4.271%±0.988%(相比DMSO组,P<0.01)。结论：视紫红质T17M突变不影响蛋白酶体活性。T17M突变能诱导细胞内质网应激,使内质网应激蛋白BIP、GRP94、CHOP、peIF-2a、eIF-2a、activeATF-6a表达上调。化学分子伴侣PBA能缓解T17M诱导的内质网应激。视紫红质T17M突变增加细胞对内质网应激诱导剂Tunicamycin的敏感性。突变的T17M视紫红质增加细胞内ROS的水平,ROS清除剂NAC和BHA能抑制视紫红质T17M突变导致的细胞死
【作者】江海波；
【导师】夏晓波；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】视网膜色素变性；视紫红质T17M突变；错误定位；内质网；高尔基体；降解；溶酶体；蛋白酶体；泛素化；内质网相关降解；细胞死亡；内质网应激；化学分子伴侣；活性氧成分；活性氧成分清除剂；

【参考文献】
[1]杨旭.王朝入室抢劫案的法理研究[D].河北大学,法律,2014,硕士.
[2]宋志刚,赵启兰.制造集团公司物流资源整合问题研究[J].北京交通大学学报(社会科学版),2014,02:1-7.
[3]杨斌,王金城.中立型一般Lurie系统绝对稳定的时滞相关准则[J].自动化学报,2004,02:261-264.
[4]冀园园.二维WS_2电子结构和磁性的第一性原理研究[D].河南师范大学,2014.
[5]刘真伦.山东能源枣矿集团柴里煤矿“安全力”建设系统研究[D].天津大学,高级工商管理,2013,硕士.
[6]刘伟.小学生时间管理小组工作计划书[D].华中师范大学,社会工作,2014,硕士.
[7]赵颖.基于生命周期评价的某轿车地板环境影响研究[D].吉林大学,工业设计工程,2014,硕士.
[8]周晓梅.硫化氢通过CaMKKβ-AMPK信号通路抑制中枢神经炎症应答[D].苏州大学,神经病学,2014,硕士.
[9]薛勇.传统吉祥图案在居住空间设计中的运用研究[D].河北科技大学,设计艺术学,2014,硕士.
[10]杨涛.基于时频分析方法的数字图像边缘检测算法及应用[D].山东大学,电路与系统,2013,硕士.
[11]王辉.贝多芬小提琴奏鸣曲的创作风格及演奏实践探寻[D].西安音乐学院,小提琴演奏,2014,硕士.
[12]邱福山.针刺远近取穴治疗神经根型颈椎病的临床疗效评价[D].广州中医药大学,针灸推拿学（专业学位）,2013,硕士.
[13]刘铠诚,何光宇,王彬,刘锋,顾志东,黄良毅.调度中心智能调度业务成熟度模型及其应用[J].电力系统自动化,2012,13:1-7.
[14]张一帆.生命困境的思考与突围[D].河北师范大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[15]张瑜.多屏交互环境下的思维导图教学研究[D].华东师范大学,教育技术学,2013,硕士.
[16]孙晓静.siRNA抑制ZNF139对胃癌细胞增殖、凋亡的影响及机制研究[D].河北医科大学,外科学,2013,硕士.
[17]周敏敏.基于CFD的石脑油裂解炉管流场结构化研究[D].华东理工大学,化学工程,2014,硕士.
[18]温东玉.以借贷形式挪用公款行为之认定[D].兰州大学,法律,2012,硕士.
[19]王富松.辽代契丹族服饰研究[D].湖南工业大学,设计艺术学,2012,硕士.
[20]王雪莹.20-HETE通过蛋白激酶C和NADPH氧化酶诱导乳鼠心肌细胞凋亡[D].东北师范大学,生理学,2012,硕士.
[21]黄平.王充《论衡》鬼神与妖异故事研究[D].西南大学,中国古代文学,2013,硕士.
[22]张杰.基于视频的交通参数检测系统的研究与实现[D].东北大学,计算数学,2011,硕士.
[23]王玲,张研,杨辉,戴晓峰,孙夕平.火山岩天然气藏评价技术研究[J].石油地球物理勘探,2008,05:540-548+484.
[24]姚婷婷.谱意义下的非交换Hardy空间[D].新疆大学,基础数学,2013,硕士.
[25]赖东.水稻光氧化基因LPOl（t）的初步定位[D].南京农业大学,作物遗传育种,2012,硕士.
[26]陈颖杰.关于日本人镜信仰的研究[D].宁波大学,日语语言文学（专业学位）,2014,硕士.
[27]徐承伟,吕勇哉.模糊系统的串联补偿解耦[J].自动化学报,1987,03:177-183.
[28]王志彦,何书美,张倩,陈曦,董森.拉曼光谱法测定煤化工产品粗苯中苯、甲苯、二甲苯的含量[J].现代化工,2014,01:169-171.
[29]张君美.组织文化与员工绩效关系研究[D].成都理工大学,企业管理,2013,硕士.
[30]汤有丽.住房公积金贷款对我国城镇居民住房需求的影响[D].南京大学,国民经济学,2013,硕士.
[31]李志磊.人脑胶质瘤中ALDH1表达及其与Ki-67和MGMT的关系研究[D].兰州大学,外科学,2014,硕士.
[32]马宏远,谢运昌,喻芳少.重钢五厂2~#板坯加热炉微型机控制系统[J].冶金自动化,1983,S1:50-57.
[33]杨守彬.浙江省农村水污染管制政策研究[D].浙江财经学院,产业经济学,2013,硕士.
[34]肖建勇.海洋平台安全风险分析方法研究[D].天津大学,船舶与海洋结构物设计制造,2003,硕士.
[35]范梦吾.高速电主轴热变形的有限元分析[D].广东工业大学,机械制造及其自动化,2004,硕士.
[36]王文珍.隔代教养大学生的生活世界[D].南京师范大学,发展与教育心理学,2012,硕士.
[37]窦元运.石墨烯基电极材料的制备与超级电容器性能研究[D].宁夏大学,2014.
[38]陈建松.高校思想政治教育网站建设研究[D].大理学院,思想政治教育,2013,硕士.
[39]殷秀兴,林勇刚,李伟,顾亚京,刘宏伟.电液数字马达变桨距控制与辨识[J].浙江大学学报(工学版),2014,05:777-783.
[40]客伟利.油气地质异常信息分析系统设计与研发[D].中国地质大学（北京）,2005.
[41]詹米璐张琴.九龙坡:以工业“园区”带动产业集群发展[N].重庆日报,2014-05-06008.
[42]黄越雯.电涡流检测在电机铁芯生产过程中的应用[D].浙江大学,电机与电器,2004,硕士.
[43]王悦军.全国石油系统第三次非地震物化探技术交流会议召开[J].石油地球物理勘探,1997,01:67.
[44]徐喆.高温超导磁阻电动机的理论研究与样机设计[D].中国科学院研究生院（电工研究所）,电机与电器,2004,硕士.
[45]程爱祥.六足机器人非结构化地形下步态生成与腿部控制研究[D].哈尔滨工业大学,机械电子工程,2014,硕士.
[46]代少云.电液比例负载敏感控制变量柱塞泵研制[D].浙江大学,2008.
[47]闫礼成.聚丙烯腈基碳纤维热稳定工艺及其机理的探讨[D].湖北大学,材料加工工程,2012,硕士.
[48]倪晔.基于J2EE的银行CRM系统设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[49]李朝静.上海市失能老人长期护理服务体系研究[D].上海工程技术大学,社会保障,2013,硕士.
[50]孙强.贵州省属医学院校医学生人文素质教育的研究[D].遵义医学院,思想政治教育,2012,硕士.