Nrf2-ARE通路对戊四氮点燃小鼠癫痫模型的脑保护作用及其机制研究

【摘要】目的：癫痫是多种病因引起的慢性脑部疾病,通过引起大脑神经元反复地、过度地超同步化放电，导致中枢神经系统功能短暂性失常的临床表现。近年的研究结果表明,人体内过多的自由基(FreeRadical,FR)积累与许多慢性疾病都与有关。氧自由基导致的氧化应激损伤目前已被广泛研究证实为癫痫发病的重要机制之一。已经有研究证明，无论是癫痫动物实验模型还是癫痫患者的脑内均存在着活跃的自由基反应，癫痫发作时自由基进一步明显增加，远远超过机体对自由基的清除能力，导致神经元和线粒体的损伤,最终可加重癫痫的发生。清除氧自由基、抗氧化的治疗方法能为癫痫的药物治疗提供新的靶点。转录因子NF-E2相关因子(NF-E2-relatedfactor2，Nrf2)是细胞氧化应激反应中的关键因子，Nrf2通过与抗氧化反应元件（antioxidantresponseelement，ARE）相互作用来调节抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达。既往研究证实，Nrf2-ARE通路对神经系统疾病如：肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森病、脑出血、脑梗死和脑外伤等，具有很强的神经保护功能，但是其在癫痫发病中抗氧化应激损伤的相关报道甚少，本实验主要研究戊四氮（pentylenetetrazoloe，PTZ）点燃慢性癫痫小鼠脑内Nrf2-ARE通路的保护作用。使用基因型为Nrf2(+)和基因型为Nrf2(-)的两种小鼠制作戊四氮（pentylenetetrazoloe，PTZ）点燃慢性癫痫小鼠模型，观察Nrf2-ARE通路阻断后戊四氮致痫小鼠痫性发作等级、小鼠海马CA1区神经细胞损伤情况及海马组织中Nrf-ARE通路表达产物血红素氧合酶-1(hemeoxygenase1，HO-1)表达量的变化情况，评价Nrf2-ARE通路对癫痫过程中神经细胞的保护作用并对其机制进行初步探讨，为阐明癫痫的病理生理机制提供实验依据，同时为癫痫治疗提供新的靶点，为抗癫痫药物的选择提供新的思路。方法：选择实验动物并分组：选择健康成年雄性C57/B小鼠，基因型为Nrf2(+)、经PCR鉴定基因型为（Nrf2-/-）的成年雄性Nrf2基因敲除（Nrf2-KO）小鼠，由河北医科大学动物实验中心及省二院神经内科实验室提供，适应性饲养1周后，随机分成四组：C57小鼠对照组（C-Control）n=30、C57小鼠致痫组（C-PTZ）n=30、Nrf2基因敲除小鼠对照组（N-Control）n=30、Nrf2基因敲除小鼠致痫组（N-PTZ）n=30。模型的制备：癫痫组采用戊四氮慢速点燃癫痫模型：腹腔注射给药：隔天给药，26天内给药13次，每次均为上午9:00-11:30进行。给药前称体重，致痫组每只小鼠腹腔注射0.5%的PTZ，剂量为32mg/kg，合0.0064ml/g，对照组按照0.0064ml/g给予生理盐水腹腔注射。注射后将小鼠放至透明箱中观察30min，记录小鼠癫痫发作的最大级别。痫性发作的发作等级变化按照Racine六级评价标准：0级，无任何反应；Ⅰ级，湿狗样抖动、面部抽搐及咀嚼；Ⅱ级，颈部肌肉痉挛表现为点头和/或甩尾；Ⅲ级，一侧前肢阵挛；Ⅳ级，双侧前肢阵挛伴立；Ⅴ级，全身阵挛，失去平衡，跌倒。戊四氮点燃过程：采用慢点燃法，隔天给予小鼠PTZ。连续三次记录到4~5级点燃即为点燃成功，纳入实验。造模成功后继续隔日给予戊四氮刺激一次，诱导癫痫发作。制模过程中小鼠出现死亡或不符合模型要求者，予以剔除并随机补充，保证每组数量30只。取材：最后一次PTZ刺激结束48小时后，每组随机选取5只小鼠用于尼氏染色技术，麻醉后用4%的多聚甲醛液灌流固定后，取小鼠海马CA1区域的脑组织标本制作成蜡块，进行尼氏染色，测定小鼠海马CA1区神经细胞数；每组随机选取5只小鼠麻醉后用1%多聚甲醛-1.25%戊二醛0.1M磷酸缓冲液灌流固定后，取小鼠海马区域的脑组织标本，经透射电子显微镜观察海马组织CA1区神经元亚细胞结构；每组取20只小鼠麻醉后快速在冰块上提取小鼠海马组织，利用westernblot技术半定量测定HO-1的含量。结果：1四组小鼠在痫性发作等级方面的比较：N-PTZ组比C-PTZ组的平均痫性发作等级显著升高（P<0.05）；N-Control组与C-Control组均无痫性发作。2四组小鼠脑组织尼氏染色海马CA1区神经元细胞数目的比较：致痫组均比空白对照组的神经元数目明显减少（P<0.05）；N-PTZ组比C-PTZ组的神经元数目显著减少（P<0.05）；N-Control组与C-Control组差异无统计学意义（P>0.05）。3四组小鼠脑组织海马神经元透射电镜观察结果比较：电镜观察示，空白对照组，即C-control组及N-control组：海马CA1区细胞大体结构未发现异常。细胞内神经元核膜清晰，胞质中细胞器丰富，胞质内可见线粒体、粗面内质网和大量的多核糖体。N-PTZ组：海马CA1区神经元细胞可见明显的大体结构损伤，出现细胞体的破碎。细胞内核膜内陷或边界不清，核质不均匀，异染色质积聚成块、增多、边集，细胞质中线粒体出现肿胀、线粒体嵴发生断裂甚至空化，粗面内质网池扩张、附着的核糖体脱落，游离核糖体解聚，重者出现胞浆空化。C-PTZ组：海马CA1区有部分神经元受损，且受损程度较N-PTZ组明显较轻，表现为核膜边界不清，细胞变形，电子密度影呈水肿表现，少数细胞质浓缩，粗面内质网排列紊乱，多聚核糖体稍减少，部分线粒体有嵴断裂现象。4四组小鼠海马区脑组织HO-1的表达westernblot半定量比较：N-control组比C-control组表达量减少（P<0.05）；N-PTZ组比C-PTZ组HO-1表达量明显减少（P<0.05）；N-PTZ组比N-control组HO-1表达量明显增多（P<0.05）；C-PTZ组比C-control组HO-1表达量明显增多（P<0.05）。结论：戊四氮点燃的慢性癫痫模型能够很好模拟了人类海马神经元的损伤。Nrf2基因缺陷小鼠的平均癫痫发作等级更高，且其海马区神经元在癫痫病程中受到更大的损伤，与此同时海马组织中血红素氧合酶-1的含量明显降低。这可能表示癫痫癫痫病程中，Nrf2基因可能对癫痫小鼠的海马神经元有保护作用，且可能是通过激活Nrf2-ARE通路进而增加脑组织中HO-1的表达来实现的。
【作者】夏蔚；
【导师】王维平；
【作者基本信息】河北医科大学，神经病学（专业学位），2014，硕士
【关键词】癫痫；Nrf2；海马；HO-1；PTZ；

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