PGP9.5、NGF在实验性小鼠子宫内膜异位症的表达及补肾温阳化瘀方对其影响

【摘要】目的：子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)，简称内异症，是妇科常见病和多发病。临床多以痛经、不孕、盆腔痛为主症。内异症疼痛严重影响患者的生活质量。已知前列腺素与妇科疼痛的关系密切，近年的研究发现内异症疼痛的发生与神经纤维增生密切相关。本研究通过实验动物模型分析神经标记物蛋白基因产物PGP9.5(ProteingeneProduct9.5,PGP9.5)、神经生长因子NGF(nevergrowthfactor,NGF)、前列腺素E2(ProstaglandinE2，PGE2)在内异症子宫内膜组织中的表达，以探讨内异症疼痛发生的部分机制；并对实验性小鼠采用补肾温阳化瘀方进行治疗，探讨补肾温阳化瘀法治疗内异症疼痛的作用机制。方法：选用健康清洁级6~8周龄近交系BALB/c小鼠80只，体重20±2g，术前两天以补佳乐0.5mg/kg灌胃，使手术时小鼠处于统一动情期(阴道涂片为大量无核角化细胞)。随机取65只小鼠参考王艳萍方法复制内异症模型，另外15只作为假手术组。将成功复制的内异症模型的小鼠60只，随机分为4组:模型组；补肾温阳化瘀方高剂量组(61.67g/kg，相当于临床用量20倍)，简称（“高剂量组”）；中药低剂量组(15.42g/kg，相当于临床用量5倍)，简称（“低剂量组”）；孕三烯酮组(0.42mg/kg，相当于临床用量10倍)。假手术组正常清洁饲养。术后1~12天采用补佳乐(0.5mg/kg)联合缩宫素(2U/只)建立痛经模型，同时给药。给药方案如下：假手术组给予纯净水灌胃1ml/100g，每日2次；模型组：上午纯净水灌胃1ml/100g，下午灌胃补佳乐；高剂量组：上午灌胃6.17g/ml浓缩液，下午灌胃补佳乐；低剂量组：上午灌胃1.54g/ml浓缩液，下午灌胃补佳乐；孕三烯酮组：每周2次上午灌胃孕三烯酮混悬液，其余时间上午给予纯净水灌胃，每天下午灌胃补佳乐；第12天末次给补佳乐后1小时，腹腔注射缩宫素2U/只(0.2ml)，诱发扭体反应，假手术组腹腔注射生理盐水0.2ml/只。扭体观察半小时，结束后断头处死，无菌操作剖腹取出异位内膜组织、在位子宫内膜组织，假手术组取子宫内膜组织，部分组织用4%多聚甲醛固定用于免疫组织化学染色，部分组织立即置于液氮中后转入-80℃冰箱用于Western-blotting及RealtimePCR检测，部分组织匀浆取上清液用于酶联免疫法检测。结果:1扭体反应除假手术组外，各组均发生扭体反应，扭体发生率100%。高剂量组、低剂量组、孕三烯酮组扭体潜伏期明显延长，与模型组相比，差异有统计学意义(均为P<0.01)，扭体次数显著减少，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，各治疗组之间差异无统计学意义(均为P>0.05)。2PGP9.5表达2.1免疫组化法检测PGP9.5蛋白表达异位内膜表达：PGP9.5蛋白阳性主要表达于异位内膜间质细胞的胞浆中。模型组PGP9.5蛋白表达高于各治疗组（均P<0.05）。PGP9.5蛋白在各治疗组表达差异无统计学意义（P>0.05）。在位子宫内膜：PGP9.5蛋白阳性主要表达于在位内膜腺体细胞的胞浆中。模型组PGP9.5蛋白表达高于假手术组（P<0.01）；PGP9.5蛋白在高剂量组、低剂量组表达高于假手术组(P<0.05)；在各治疗组表达差异无统计学意义（P>0.05）。2.2Western-blotting检测PGP9.5蛋白表达异位内膜表达：模型组PGP9.5蛋白表达高于各治疗组（均P<0.01）。PGP9.5蛋白在各治疗组表达差异无统计学意义（P>0.05）。在位子宫内膜：模型组PGP9.5蛋白表达高于假手术组（P<0.01）；PGP9.5蛋白在高剂量组、低剂量组的表达高于假手术组(P<0.05)；PGP9.5蛋白在各治疗组表达差异无统计学意义（P>0.05）。2.3RealtimePCR检测PGP9.5mRNA的表达异位内膜表达：模型组PGP9.5mRNA的表达高于各治疗组（均P<0.01）。PGP9.5mRNA在高剂量组表达低于孕三烯酮组（P<0.05）；低剂量组与孕三烯酮组比较差异无统计学意义（P>0.05）；高剂量组低于低剂量组（P<0.05）。在位子宫内膜：模型组PGP9.5mRNA表达高于假手术组（P<0.01）。PGP9.5mRNA在高剂量组、低剂量组表达高于假手术组(P<0.05)；PGP9.5mRNA在高剂量组的表达低于孕三烯酮组(P<0.01)；低剂量组与孕三烯酮组比较差异无统计学意义(P>0.05)；高剂量组低于低剂量组(P<0.01)。3NGF的表达3.1免疫组化法检测NGF蛋白表达（均P<0.01）异位内膜：NGF蛋白阳性主要表达于异位内膜间质细胞的胞浆中。模型组NGF蛋白表达高于各治疗组（均P<0.01）；NGF蛋白在各治疗组表达差异无统计学意义（P>0.05）。在位子宫内膜：NGF蛋白阳性主要表达于在位内膜间质细胞的胞浆中。模型组NGF蛋白表达高于假手术组（P<0.01）；NGF蛋白在高剂量组、低剂量组表达高于假手术组(P<0.05)；NGF蛋白在各治疗组表达差异无统计学意义（P>0.05）。3.2Western-blotting检测NGF的表达异位内膜：模型组NGF蛋白表达高于各治疗组（均P<0.01）；NGF蛋白在各治疗组表达差异无统计学意义（P>0.05）。在位子宫内膜：模型组NGF蛋白表达高于假手术组（P<0.01）；高剂量组、低剂量组与假手术组表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；NGF蛋白在各治疗组表达差异无统计学意义（P>0.05）。3.3RealtimePCR检测NGF的表达异位内膜表达：模型组NGFmRNA表达高于各治疗组（均P<0.01）。NGFmRNA在高剂量组表达低于孕三烯酮组（P<0.01）；低剂量组低于孕三烯酮组（P<0.05）；高剂量组低于低剂量组（P<0.05）。在位子宫内膜：模型组NGFmRNA的表达高于假手术组（P<0.01）。NGFmRNA在高剂量组表达与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)；高剂量组低于孕三烯酮组(P<0.01)；低剂量组与孕三烯酮组比较差异无统计学意义(P>0.05)；高剂量组低于低剂量组(P<0.01)。4酶联免疫法检测组织匀浆中PGE2的水平异位内膜:模型组PGE2水平与各治疗组比较差异有统计学意义(均P<0.01)。高剂量组PGE2水平低于孕三烯酮组(P<0.05)；低剂量组与孕三烯酮组比较差异无统计学意义（P>0.05）；高剂量组PGE2水平低于低剂量组(P<0.01)。在位子宫内膜:模型组PGE2水平高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.01)。高剂量组PGE2水平高于假手术组（P<0.05）；高剂量组低于孕三烯酮组（P<0.05）；低剂量组与孕三烯酮组比较差异无统计学意义（P>0.05）；高剂量组低于低剂量组（P<0.01）。5PGE2、PGP9.5、NGF的相关性：异位内膜及在位子宫内膜PGE2、PGP9.5、NGF作直线相关性检验。PGE2与PGP9.5(r=0.755,P=0.0005;r=0.456,P=0.044)；PGE2与NGF（r=0.747,P=0.0025;r=0.336,P=0.11）。NGF与PGP9.5(r=0.906,P<0.01;r=0.964,P<0.01),呈显著正相关。结论：1行为学、大体标本、病理学三方面证实了子宫内膜异位症痛经模型的建立成功，可用于临床疾病的研究。2NGF、PGP9.5在内异症痛经模型的在位子宫内膜、异位内膜表达升高，且二者呈正相关关系。提示NGF促进神经纤维生长，局部神经纤维增生，参与内异症疼痛的发生。3PGE2在内异症痛经模型的在位子宫内膜、异位内膜组织中表达升高，PGE2与NGF、PGP9.5表达在异位内膜呈正相关。提示PGE2可能促进异位内膜中NGF表达，进而与局部神经增生有关。4补肾温阳化瘀方可缩小移植内膜组织体积并具有镇痛作用。同时补肾温阳化瘀方可以降调内异症异位内膜及在位子宫内膜中升高的NGF、PGP9.5、PGE2表达，提示该法可通过调节病灶局部及在位子宫内膜NGF、PGP9.5、PGE2水平，起到治疗内异症疼痛的作用。该作用效果同孕三烯酮。
【作者】仝瑞晓；
【导师】杜惠兰；
【作者基本信息】河北医科大学，中西医结合临床，2014，硕士
【关键词】子宫内膜异位症；疼痛；神经生长因子(NGF)；蛋白基因产物9.5(PGP9.5)；前列腺素E2(PGE2)；补肾温阳化瘀方；中药；

【参考文献】
[1]常丽丽.纳西东巴经《请神压端鬼·端鬼的来历》用字研究[D].西南大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[2]张晓倩.文科硕士研究生学习生活现状调研[D].兰州大学,高等教育学,2013,硕士.
[3]李亮伟.涉及计算机程序发明专利等同侵权研究[D].西南政法大学,知识产权法（专业学位）,2012,硕士.
[4]刘泽念.紫杉醇类联合卡铂经不同途径治疗兔VX-2舌癌的实验研究[D].遵义医学院,口腔临床医学,2014,硕士.
[5]左申正.基于机器学习的网络异常分析及响应研究[D].北京邮电大学,2010.
[6]刘杰.基于LabVIEW的航空机电计算机测试系统设计与开发[D].西安电子科技大学,计算机系统结构,2012,硕士.
[7]王在民,朱鹏飞,于浩业,郭宏宪,其其格,蒋立.时频域自动识别与压制高频噪声[J].石油地球物理勘探,2006,01:93-96+122+128-129.
[8]唐婷.中国期铜跨市套利研究[D].上海社会科学院,金融学,2012,硕士.
[9]于立红.凤城高家堡子—小佟家堡子金银多金属隐伏矿床特征及其成矿模式研究[D].吉林大学,地质工程,2014,硕士.
[10]本报编辑部.2010年国外IT十件大事[N].电脑报,2011-01-03A04.
[11]王奕涵.外资并购对我国大豆产业发展影响分析[D].首都经济贸易大学,国际商务（专业学位）,2014,硕士.
[12]张翠玉.Cerebrolysin治疗吉兰—巴雷综合征的疗效观察[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[13]黄文娟.国有控股企业高管薪酬与在职消费[D].江西财经大学,会计学,2013,硕士.
[14]顾飞.基于SPARC架构面向确定性重演的多核访存竞争记录方法的研究[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[15]林红岩.当代中国大众文化问题研究[D].山东大学,马克思主义基本原理研究,2013,硕士.
[16]张倩.思想政治教育与大学生心理健康[D].鲁东大学,思想政治教育,2013,硕士.
[17]王艳青.中学数学教科书中勾股定理内容编排的演变研究（1949～2011）[D].内蒙古师范大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[18]刘建文,谢雨晴,陈楠.高效水煤浆制浆燃烧集成技术研制与应用[J].洁净煤技术,2015,02:35-39+44.
[19]黄晓晓.基于情景语料库的自然手语构词研究[D].南京师范大学,语言学及应用语言学,2012,硕士.
[20]潘勇,程敏,刘保国.随机变刚度电磁支撑-转子-轴承系统不定动力参数实验识别[J].实验力学.
[21]姚志红,陈铁军,冯冬青.火电厂生产过程故障诊断神经网络专家系统[J].控制与决策,1997,03:252-255+273.
[22]花斌.现当代工笔花鸟画图式研究[D].新疆师范大学,美术学,2013,硕士.
[23]焦光普.延长组长6油层化学法提高原油采收率技术优化研究[D].东北石油大学,油气田开发工程,2013,硕士.
[24]施德胜.陶粒体积分数对陶粒混凝土破坏行为的影响[D].宁波大学,工程力学,2013,硕士.
[25]谢娅.PLGA/MWNTs复合电纺支架在肌肉组织工程中的研究[D].华东理工大学,流体机械及工程,2014,硕士.
[26]陈灏.科技支撑能力与现代服务业发展研究[D].山东财经大学,国际商务（专业学位）,2013,硕士.
[27]杜娟.压铸镁合金熔化焊接气孔的形成机理及消除措施[D].重庆大学,材料加工工程,2014,硕士.
[28]贾晶霞.马铃薯挖掘铲参数优化与性能分析[D].河北农业大学,2003.
[29]李兵强,吴春,林辉.基于参考输入学习的永磁同步电机高精度位置伺服系统[J].中国电机工程学报,2012,03:96-102+10.
[30]高卫利.ABBIndustrialIT在蓄热式加热炉生产中的开发与应用[J].冶金自动化,2007,05:69-70.
[31]吴慰慈.从信息资源管理到知识管理[J].图书馆论坛,2002,05:12-13+41.
[32]顾小勇.减反特性的微纳复合结构的制备和研究[D].苏州大学,光学工程,2013,硕士.
[33]张秦南.西安邮政处理中心预算管理体系的改进研究[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[34]杜建伟.组织职业生涯管理对80后员工工作满意度影响的研究[D].内蒙古财经大学,企业管理,2012,硕士.
[35]郝春雨.基于视频特征的火灾火焰检测研究[D].大连海事大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[36]杨婧.基于外部性的丽江古城旅游可持续发展研究[D].西南民族大学,中国少数民族经济,2013,硕士.
[37]石娟,张曼莉,孙汉巨,陈晓燕,娄秋燕,刘宁,王霄.黑米花青素的体内抗氧化[J].食品工业科技.
[38]范茜.营养摄入、GH/IGF-1轴与早产极低出生体重儿生后早期生长发育的关系[D].广州医科大学,儿科学（专业学位）,2014,硕士.
[39]王磊.洛阳房地产平面广告的多模态意义构建分析[D].河南科技大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[40]唐维彦.中职数学教学应注重数形结合[J].中国校外教育.
[41]朱国明,施志诚,张汝惠,高为炳.张力线速度复合控制系统的应用分析[J].自动化学报,1989,03:254-260.
[42]陶治坤.济川煎加味预防人工膝关节置换术后便秘的临床疗效观察[D].北京中医药大学,中医学,2014,硕士.
[43]周健祥.基于神经网络入侵检测系统的研究与实现[D].东北农业大学,2004.
[44]陈芳.《沧浪诗话》明代接受研究[D].复旦大学,中国文学批评史,2013,博士.
[45]储丽丽.基于有限元分析和质点弹簧模型的软组织形变仿真研究[D].哈尔滨工业大学,机械电子工程,2014,硕士.
[46]雷红萍.基于FPGA的激光驱动系统研究与设计[D].西安工业大学,控制工程,2014,硕士.
[47]刘承军,陈东兴.首钢矿业烧结厂余热锅炉激波吹灰效益显著[J].冶金自动化,2006,03:68.
[48]陆晶,赛英.基于综合度量的关联规则挖掘算法[J].计算机工程,2004,22:89-90+131.
[49]霍虎伟.航海模拟器中全回转拖轮操纵运动建模与仿真[D].大连海事大学,交通信息工程及控制,2013,硕士.
[50]文美娟.全桥LLC谐振变换器研究[D].西安科技大学,电力电子与电力传动,2013,硕士.