白芍有效成分芍药苷的测定及其干预胶原诱导性关节炎大鼠的定量蛋白质组学研究

【摘要】目的：用超高效液相色谱法测定白芍中有效成分的含量及经白芍灌胃后吸收入血的成分；用定量蛋白质组学方法研究胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠滑膜组织蛋白质表达的改变,绘制其信号转导网络图谱,寻找网络的重要节点,探讨类风湿关节炎(RA)发生发展的机制；采用该有效成分进行干预,探索其对CIA大鼠滑膜组织蛋白质表达的影响及对信号转导网络的调控作用,阐释其治疗RA的分子机制,为阐明痹肿消汤治疗RA的疗效物质基础奠定基础。方法：(1)采用UPLC-PDA法测定白芍汤剂中的有效成分含量,绘制标准曲线,并对其精密度、回收率、样本稳定性和重复性进行验证。色谱柱为ACQUITYUPLCBEHC18(2.1x50mmColumn,1.7gm),流动相：乙腈(A2)和1%醋酸水(B2),梯度洗脱,流速：0.25mL/min,柱温：40℃,检测波长：190-480nm。(2)给正常SD大鼠灌胃白芍汤剂30min后取血,运用上述UPLC-PDA法对大鼠血浆中有效成分进行定性检测。(3)以低、中、高剂量的芍药苷标准品溶液灌胃干预,用酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)检测血清炎性细胞因子IL-1β、TNF-α的含量,筛选出治疗CIA大鼠的芍药苷最佳剂量。(4)采用牛Ⅱ型胶原蛋白混合完全弗氏佐剂的方法诱导SD大鼠胶原诱导性关节炎(CIA)动物模型,并以上述筛选出的最佳剂量灌胃干预CIA大鼠,动态观察大鼠的一般情况、体重增长数、关节炎指数积分、关节肿胀度、关节X线摄片及关节滑膜组织病理学改变,用ELISA同步检测各组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平。(5)定量蛋白质组学检测：提取各组42d滑膜组织,抽提总蛋白,对提取的蛋白进行酶解消化,分别用不同的iTRAQ试剂进行标记,检测标记结果,混合,经过SCX/RPLC分离,LC-MS/MS鉴定各组差异表达的蛋白；采用IngenuityPathwayAnalysis(IPA)软件进行生物信息学分析,包括分析生物功能、经典通路和绘制蛋白相互作用网络图等。结果：(1)在不足4min内,白芍汤剂中的芍药苷成分获得良好分离。测得白芍生药中芍药苷含量为0.74mg/g。芍药苷在其检测范围内线性关系良好,R2>0.9994；日内、日间精密度良好,其相对标准差(RSD)波动在0.99%-3.64%之间；芍药苷的加样回收率良好,加样回收率在98.6%～103.6%之间,RSD<2.8%；白芍汤剂在24小时内稳定性良好,RSD<2.7%。(2)灌胃白芍汤剂30min后健康SD大鼠的血浆中可测出芍药苷成分。(3)中剂量的芍药苷标准品溶液(1mg/kg.d)能显著下调CIA大鼠血清IL-1β、TNF-α水平,是本实验中芍药苷对CIA大鼠抗炎治疗作用的最佳剂量。(4)采用牛Ⅱ型胶原蛋白混合完全弗氏佐剂的方法成功诱导SD大鼠胶原诱导性关节炎动物模型,第14天进行模型评价,成功率达90%。用上述最佳剂量干预CIA大鼠后：从一般情况来看,CIA大鼠经免疫后出现了精神萎靡,少动嗜睡,行动迟缓,饮食减少,毛发枯燥等症状,到第42天有部分大鼠出现,关节变形,负重困难,活动障碍,治疗组、正常组大鼠活泼好动,进食多,毛色光泽柔软。且CIA大鼠体重增长比正常大鼠明显降低。从炎症反应来看,CIA大鼠于免疫后第1周就出现了足爪肿胀,而且随着免疫时间的延长而肿胀加重。关节炎指数评分显示,CIA大鼠于免疫后第1周关节炎指数积分升高,并在21天左右达到了高峰。治疗组在21天、28天、35天、42天发病程度明显轻于模型组(P<0.05)。关节组织病理学显示CIA大鼠滑膜组织增生、血管翳形成,并伴有炎症细胞浸润,治疗组可见少量炎症细胞浸润,滑膜轻度增厚。随着时间推移炎症逐渐减轻。通过关节X线摄片发现与正常组大鼠相比,CIA大鼠出现了骨质疏松、关节间隙模糊、变窄等表现,治疗组关节炎大鼠关节周围软组织肿胀程度较模型组低,关节骨骼破坏程度明显减弱。用ELISA检测各组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平发现模型组和治疗组两个指标水平都有上升,经过芍药苷治疗后,大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明显下降。(5)经过IPA分析后,模型组与正常组比较共128个差异点得到鉴定,其中44个下调,84个上调,经芍药苷治疗后44个下调蛋白中9个蛋白表达上调,84个上调蛋白中14个蛋白表达下调,19个与正常组表达无差异。发现了69个与类风湿关节炎相关的经典通路,包括IL-1信号,IL-6信号,Wnt/β-catenin信号通路、G蛋白偶联信号通路、cAMP信号通路等,并绘制了蛋白相互作用的网络图。结论：(1)超高效液相色谱法能很好地测定白芍汤剂中芍药苷的成分。(2)发现白芍汤剂中芍药苷为大鼠血浆可吸收的成分,该成分可能是白芍治疗RA的有效成分,可能是痹肿消汤治疗RA的药效物质基础。(3芍药苷可以降低炎性细胞因子IL-1β、TNF-α的水平,抑制胶原诱导性关节炎大鼠的炎症反应。(4)RA的发病机制为多个异常蛋白的表达及多条信号转导通路改变所构成的复杂的信号网络所致,芍药苷干预后能逆转多个蛋白的表达,作用了多个信号转导通路的节点,并调控其参与的信号转导通路,这可能就是痹肿消汤中白芍的有效成分芍药苷治疗RA的作用机制。
【作者】吴丹；
【导师】梁清华；熊新贵；
【作者基本信息】中南大学，中西医结合临床，2013，博士
【关键词】超高效液相色谱；芍药苷；类风湿关节炎；定量蛋白质组学；iTRAQ；信号通路网络；

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