样本中免疫球蛋白自由轻链含量测定方法的研究

【摘要】目的：开发一种新型的检测方法,来测定血清及尿中免疫球蛋白自由轻链K和λ链的含量。方法：体外培养抗人免疫球蛋白自由轻链K和λ链的单克隆抗体,并纯化,然后将单克隆抗体共价键连接到bead上,同时测定其连接效果。连接生物素到免疫球蛋白自由轻链K和λ链上,测定生物素结合到自由轻链上的效果。将含有抗自由轻链K及抗自由轻链λ抗体的微球Beads混合,加入连接有生物素的自由轻链K和λ链,同时加入待测样本,采用竞争试验法原理,反应一段时间后,在Luminex200仪器上读数,得到样本中自由轻链K和λ链的含量。对混合二种Beads测定免疫球蛋白自自由轻链的方法特异性,敏感性,重复性及稳定性进行评估。测定200名正常人血清和600名骨髓瘤病人血清中自由轻链K和λ链的含量,并与比浊法进行比较。结果：当单克隆抗体被连接到Beads上时,连接有R-藻红蛋白(R-phycoerythrin,R-PE)的羊抗小鼠IgG的抗体就能与Beads上的抗体特异性的结合,在Luminex仪器检测时,连接有抗自由轻链K和λ链抗体的Beads的平均荧光强度值明显高于没有连接抗体的Beads。连接生物素到免疫球蛋白自由轻链K和λ链上,取连接有抗自由轻链K和λ链抗体的Beads,与生物素自由轻链特异性反应,然后再与亲和素StreptavidinR-phycoerythrinConjugate(SAPE)反应,在Luminex仪器中检测时,连接有生物素的自由轻链K和λ链的平均荧光强度值高。将抗自由轻链K的抗体连接到一个编码的微球Beads上,抗自由轻链λ的抗体被连接到另一个编码的微球Beads上。混合二种连接有抗体的Beads,加入少量的待测样本,就可以同时测定样本中免疫球蛋白自由轻链K和λ链的含量。让含有抗体的微球Beads与自由轻链k和自由轻链λ反应,同时也与结合型轻链k和结合型轻链λ反应。结果是含抗自由轻链k抗体的微球Beads与生物素自由轻链K发生特异性反应,而与生物素自由轻链λ及生物素结合型轻链k和λ无交叉反应,含抗自由轻链λ抗体的微球Beads也只与生物素自由轻链λ发生特异性反应,不与生物素自由轻链K及生物素结合型轻链k和λ发生交叉反应。当自由轻链k的浓度为3.75,32.24和104mg/L时,测定中的变异系数CV为2.2%,3.4%,4.2%,测定间的变异系数CV为9.7%,10.4%,12.4%,当自由轻链λ的浓度为2.70,34.51和107.79mg/L时,测定中的变异系数CV为3.2%,4.4%,5.2%,测定间的变异系数CV为9.8%,12.7%,14%。自由轻链K和λ的最低检测浓度为0.4mg/L。连接有抗体的微球Beads,保存在4。C冰箱内,有效期为6个月。将单克隆抗体保存在-20。C冰箱内,12个月后,再次将抗体连接到相对应的微球Beads上,抗体仍然发挥作用。让含抗自由轻链k和抗自由轻链λ抗体的微球Beads混合在一起,与样本反应,来同时测定样本中的自由轻链k和自由轻链λ的浓度,二种Beads之间的测定不相互干扰。用混合Beads法测定200个正常人和600个骨髓瘤病人血清中的自由轻链K和λ,同时用比浊法测定相同的样本,比较二种方法得到的自由轻链K和λ值,比浊法测定在低值区间出现空白区带,是由于这种方法需要稀释样本,由此造成的不能测定的区域值,而混合Beads法却没有这个问题。比浊法不能同时测定自由轻链κ和λ值,而混合二种Beads的检测方法则可以,这样能减少检测样本的时间,提高检测效率,减低检测成本。混合Beads测定方法还有一个最大的特点是,我们可以根据需要,加入更多待测定指标的Beads,例如：白蛋白,球蛋白等的测定,用少量的样本,一次测定可得到所有要检测指标的结果。结论：混合二种Beads测定免疫球蛋白自由轻链K和λ链含量的方法,是一种简单快速敏感,特异性强及重复性和准确性均高的检测方法,将这种方法应用到临床诊断疾病上将会有很好的发展前景。
【作者】王雁云；
【导师】张阳德；
【作者基本信息】中南大学，生物医学工程，2013，博士
【关键词】轻链型；免疫球蛋白；特异性反应；抗体反应；平均荧光强度；单克隆抗体；比浊法；骨髓瘤细胞；变异系数；beads；

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