检查点激酶Rad3和Rad17在重组修复中作用机制研究

【摘要】基因损伤修复常与癌症的发生密切相关。酵母作为单细胞的真核生物,是基因损伤修复机制研究的良好材料。在裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)中,Rad3是监控DNA能否正常复制,决定细胞能否进入M期的S/G2期检查点激酶蛋白。基因损伤可激活该蛋白,并阻止细胞停留在S/G2期,直至基因组修复完成。Rad17同样为细胞周期S/G2检查点蛋白,在基因损伤时,该蛋白具有募集并引导9-1-1(RAD1-RAD9-HUS1)复合物在染色质上形成环型夹钳,同样阻止DNA错误复制并促使DNA进行修复。研究Rad3和Rad17在基因损伤后修复机制中的作用对于探究癌症发生与癌症治疗具有重要价值。在酵母的mat1位点旁侧,存在着一个影响DNA复制的特殊序列RTS1(replicationterminationsequence1),该序列与Rtf1(replicationterminationfactor1)蛋白结合后,可阻止朝向中心粒的DNA单向复制,从而引起DNA链的断裂和随后的同源重组,参与酵母的交配型转变。在同源重组的建立过程中,Exo1、Rad22、RPA和Rhp51四种蛋白发挥着重要作用。研究表明,利用RTS1和Rft1的复制单向通过机制可以用于同源重组修复机理的研究。因此,本论文采用了一个uraR系统,该系统包含一个复制终止序列RTS1,一个检测基因ura4,和一个添加有受硫胺素调控启动子nmt41的rf1基因所组成。通过硫胺素调节,对上述两检测点蛋白Rad3和Rad17在复制受阻条件下,对同源重组蛋白Rad22,RPA,Rhp51和Exol在基因ura4两侧的募集水平进行了检测,以阐明检测点蛋白在酵母同源重组修复中的作用与功能。本论文首先以rad3、radl7和exol单缺失突变体、含有蛋白标签的rad22、rpa、rhp51、exol和含有uraR系统的裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)菌株为材料,通过减数分裂重组(geneticcross)方法构建本研究所需的所有菌株,继而,采用含硫胺素培养基培养,随后去除硫胺素,激活rft1基因表达并继续培养,以启动依赖RTS1序列的复制叉阻滞。菌体经离心收集后,采用染色质免疫共沉淀技术和实时荧光定量PCR,分析Rft1表达(复制停止)与不表达(复制正常进行)两种状态下,Rad22,RPA和Rhp51分别在rad3.d,rad17.d单缺失与rad3.d、rad17.d双缺失情况下,在uraR区域的募集情况。结果表明,在Rtf1表达条件下,rad3.d缺失菌的Rad22,RPA,Rhp51相对野生型募集均显著升高；radl7.d缺失菌的3个蛋白募集量相比野生型却严重减少；双缺失rad3.d,rad17.d菌蛋白募集情况与radl7.d菌结果相同。显示出Rad3和Rad17在激发同源重组中的功能差异。由于Exo1为核酸外切酶,参与损伤DNA的单链剪切,以启动Rad22等后续蛋白的结合,因此,采用染色质免疫共沉淀技术和实时荧光定量PCR,对其在DNA上的聚集水平进行检测的结果极不理想,那么是否可以以Rad22为检测对象,通过研究Exol缺失状态下的募集水平来反证Exol的活性?为此,依照上述设想,采用上述方法,我们的实验结果显示：在Rtf1表达条件下,exol.d缺失菌中的Rad22募集量比野生型明显减少,该类似结果同样发生在ad3.d、exo1和rad17.d、exo1.d两种菌株,因而证实Exol的确参与了同源重组,其功能发挥切实与Rad3和Rad17的调控相关。为进一步探究Rad3和Rad17对RTS1所引起的基因重组类型的影响,本论文采用了一个含有两个ade6点突变、一个完整his+基因和存在于中间的RTSl序列的腺嘌呤缺陷型(.xde6-L469-his+-RTS1-ade6-M3759)重组菌株进行检测。波动实验(fluctuationtest)结果显示,在重组菌株中,Rtfl表达比不表达所产生的ade6+回复突变率高出6.9倍；rad3.d缺失后,重组率进一步增加至12.5倍,而radl7.d突变仅为基础水平的3.7倍。依照突变子中his+基因的存在与否,发现所产生的重组类型主要为his+基因缺失的重组突变。综合上述研究结果,可以得出以下结论：1、对于Rtf1所引起的复制停滞,检查点激酶Rad3抑制重组蛋白Rad22,Rhp51,RPA募集到RTS1序列,抑制同源重组修复。与之相反,Rad17促进重组蛋白的募集,促进同源重组的进行。2、Exol在同源重组中起到重要作用,Rad3对重组蛋白的抑制作用需要Exo1的存在,可能是通过调控Exol从而调节重组蛋白结合的单链DNA长度来起作用。3、通过重组实验证明,Rad3抑制同源重组,Rad17促进同源重组。
【作者】李晓陀；
【导师】郑继平；
【作者基本信息】海南大学，发育生物学，2013，硕士
【关键词】DNA损伤；复制叉阻碍；裂殖酵母；检查点；同源重组修复；

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