斜带石斑鱼神经肽MCH和NPB的克隆鉴定及摄食调控功能研究

【摘要】在啮齿动物中,黑色素聚集激素(Melanin-concentratinghormone,MCH)和神经肽3(NeuropeptideB,NPB)与许多复杂的生理活动有关,如调节摄食行为与体重、睡眠与觉醒以及体内能量平衡等。本研究的目的在于探索斜带石斑鱼(orangen-spottedgrouper,Epinepheluscoioides)中神经肽MCH和NPB与摄食相关的调控功能。本文对斜带石斑鱼转录组数据比对分析后,利用分子生物学实验技术并结合比较基因组学技术,首次在斜带石斑鱼中克隆鉴定了MCH与NPB各自的两种亚型基因,分别是MCH1、MCH2、NPB1和NPB2。通过利用实时荧光定量PCR技术(realtime-PCR)和原位杂交技术,分别研究了MCHs与NPBs在不同的器官组织中的表达模式和MCHs在不同的胚胎发育阶段中的表达模式及脑区定位。此外,我们在斜带石斑鱼的饥饿与复投喂实验中对MCHs和NPBs的mRNA表达水平进行了检测；并结合离体实验,即使用人工化学合成的两种成熟肽MCH1和MCH2刺激离体的下丘脑并进行孵育试验,检测调控摄食的相关因子的mRNA表达水平,进一步研究这两种神经肽对摄食的调控作用。主要的研究结果如下：1.利用基因克隆技术和基因组数据库及转录组数据库的数据比较分析,我们在斜带石斑鱼中分别克隆出了MCH和NPB各自的两种亚型基因的全长序列。其中,MCH1和MCH2的开放阅读框(OpeningReadingframe,ORF)全长为408bp和435bp,分别编码135和144个氨基酸的蛋白质序列；NPB1和NPB2的ORF分别为393bp和387bp,各自编码了130和128个氨基酸的蛋白质序列。通过生物信息学数据分析和信号肽及其成熟肽的预测,在MCHs和NPBs氨基酸序列的N端分别预测了信号肽结构；在MCHs氨基酸序列的C端的则由含相同数目而序列不同的环形氨基酸组成两个成熟肽结构；而NPBs的成熟肽结构则紧随在信号肽序列之后。在不同物种的全长氨基酸序列同源性比对和进化树的数据分析中显示出,斜带石斑鱼的MCH2与哺乳动物的MCH较为相似,其同源性高达61%；而NPB1则与哺乳动物的NPB同源性较高。2.通过实时荧光定量PCR技术在斜带石斑鱼的不同器官组织中对MCHs和NPBs的mRNA的表达水平进行了空间表达模式的检测,所有的数据都表明了,MCHs和NPBs基因在脑区中广泛表达,特别是在下丘脑中的表达丰富,而在某些外围组织器官中也有相应的表达。利用原位杂交技术,在斜带石斑鱼中对MCHs基因进行脑区定位,结果进一步表明了MCH1和MCH2主要分布在斜带石斑鱼的下丘脑中。这些数据揭示了MCHs和NPBs主要分布在下丘脑中,可能与摄食调控功能有关。3.采用反转录PCR和实时荧光定量PCR技术对斜带石斑鱼不同的胚胎发育过程中的MCH1和MCH2的表达模式进行了检测。结果发现这两种基因在不同的胚胎发育期有不同的表达,均呈现出先微下调然后上调,上调至原肠期最高后有逐渐下调,最后可能趋于平稳的表达模式变化。结果显示出MCH1和MCH2存在于整个生命过程中,并伴随着生长活动可能发挥某些调控作用。4.通过饥饿与复投喂试验和下丘脑离体孵育实验,并结合反转录PCR和实时荧光定量PCR技术分别对斜带石斑鱼的MCHs和NPBs及其相关摄食调控因子的mRNA表达水平进行了检测,结果显示MCH和NPB均与斜带石斑鱼的摄食调控功能相关。
【作者】李伟萍；
【导师】林浩然；
【作者基本信息】海南大学，水产养殖，2014，硕士
【关键词】斜带石斑鱼；黑色素聚集激素(MCH1和MCH2)神经肽B(NPB1和NPB1)；基因克隆；摄食调控；

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