番木瓜三种RNA病毒外壳蛋白抗血清制备及应用

【摘要】番木瓜(CaricaPapayaL.)是一种广泛种植于热带和亚热带地区的重要经济作物,具有很高的经济价值和营养价值,随着种植面积的不断扩大,病毒病成了限制番木瓜种植及其产业发展的最大障碍。世界上危害番木瓜种植的病毒主要有3种：分别是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)番木瓜环斑病毒(papayaringspotvirus,PRSV)、番木瓜畸形花叶病毒(Papayaleafdistortionmosaicvirus,PLDMV)和马铃薯X病毒属(Potexvirus)的番木瓜花叶病毒(Papayamosaicvirus,PaMV)。这三种病毒感染番木瓜后的表现症状极为相似,在生产上给鉴别和防治带来了诸多困难。为了提高病毒病源鉴定准确度,有针对性地采取防治措施,作者在本实验室保存的PRSV.PLDMV和PaMV的全长基因组上分别获得外壳蛋白(CoatProteingene,CP)基因,对其进行原核表达并制备了特异性抗血清,利用间接ELISA法对海南番木瓜病毒的分布情况进行了调查。取得的主要结论如下：(1)根据PRSV、PLDMV和PaMV的基因组全长序列(Genbank登陆号分别是HQ424465、JX974555和JX524226),设计CP基因全长扩增引物,PCR扩增出两端含有NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点的CP基因,同时对扩增片段和表达载体的酶切,再用T4连接酶将酶切片段和载体连接,一步构建了原核表达载体pET28-PRSVCP、pET28-PLDMVCP和pET28-PaMVCP;(2)将三个重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析,结果显示三个CP基因均得到高效表达,其中表达产物PRSVCP和PLDMVCP以不可溶的包涵体形式存在,PaMVCP以可溶蛋白形式表达。用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化后的蛋白经过透析后,浓度分别为0.95mg/mL、0.84mg/mL和1.12mg/mL,纯度分别是90%、95%和91%。(3)采用纯化的3种病毒CP蛋白免疫大白兔制备了3种病毒CP蛋白的高特异性抗血清,效价达到了512,000以上,Westernblot检测结果表明这三种病毒的抗血清具有高特异性,并且只与对应的病毒发生反应,不会发生交叉反应；(4)利用3个高特异性抗血清采用ID-ELISA技术,对海南地区283个病毒感染发病番木瓜(叶片)样品进行了检测,在检测的样品中,有170个样品感染了PRSV,占60.2%,在各个市县均有发现；有12个样品感染了PLDMV,占4.2%,只分布于乐东和东方地区；感染PaMV的样品有2个,占0.7%,仅在海口有发现。本研究结果初步确立了海南地区这三种番木瓜病毒的分布情况,为下一步采取针对性的有效方法进行防治提供了科学依据。
【作者】杨勇；
【导师】周鹏；
【作者基本信息】海南大学，农业生物技术，2014，硕士
【关键词】番木瓜；外壳蛋白；抗血清；ID-ELISA；病毒病；

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