文心兰ACC合成酶基因的克隆及其表达分析

【摘要】热带兰花生产是高科技农业重要组成部分,是当今国内外最具活力的产业之一。文心兰(Oncidium)是兰科文心兰属植物总称。文心兰作为重要的热带兰花种类,在热带兰花产业中占有重要的比重。兰科植物花朵的衰老过程为典型的呼吸跃变型,乙烯是主要的调控因子。在高等植物乙烯生物合成过程中,ACC合成酶是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)转化为ACC这一个过程中的关键酶,是乙烯合成途径的限速酶。在分子水平研究改变文心兰切花的衰老时间,对目前热带兰花产业具有重要的意义。本研究选用从切花主栽品种O.GowerRamsey选育出的“黄金2号’’(OncidiumGoldenNO.2)(由台湾省大地兰园选育)作为实验材料,利用RACE技术克隆了ACC合成酶基因OnACS2(GeneBank登录号：KJ004563)cDNA全长。并对其进行了序列的生物信息学分析、表达特征分析及功能鉴定,获得如下结果：1.采取CTAB-LiCl法提取文心兰不同组织器官的总RNA,经电泳检测分析,条带单一符合后面的分子克隆实验要求。根据ACC合成酶基因的保守区域设计引物,PCR扩增获得了OnACS2基因的中间片段,利用RACE技术克隆到OnACS2基因的3’端和5’端序列,获得一条长度为1557bp大小的OnACS2基因cDNA全长序列,编码435个氨基酸残基、分子大小为49.1kDa、pI为7.51的蛋白；使用特异引物对OnACS2基因组进行LA-PCR扩增,得到的片段经序列比对,发现OnACS2基因包含有3个内含子、4个外显子；OnACS2氨基酸序列经比对发现,具有ACS基因家族共有的特性,氨基酸序列具有7个保守区域、11个保守碱基和丝氨酸活性中心。2.原核表达分析,成功构建了原核表达载体pET-OnACS2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析得到了一条大小与预测相近的蛋白条带：进一步研究ACC合成酶的特性,从含有pET-OnACS2的工程菌液中提取ACS蛋白,通过酶促反应测定其生物活性,检测结果表明在大肠杆菌中表达的ACS蛋白与自然状态的ACS蛋白生物活性相似。3.分析OnACS2在文心兰不同组织器官中的表达情况,经Real-timePCR分析得出,OnACS2基因在文心兰的花蕊柱组织中的表达量最高,花瓣、花萼、唇瓣等其它组织中OnACS2基因有少量的表达。4.分析文心兰花朵衰老过程中OnACS2基因的表达特征、乙烯释放规律,确定花朵衰老、OnACS2基因的表达和乙烯释放规律三者之间的关联。结果表明,组织中OnACS2基因mRNA的积累会导致乙烯释放速率的加速。
【作者】石乐松；
【导师】刘进平；
【作者基本信息】海南大学，作物遗传育种，2014，硕士
【关键词】文心兰；ACC合成酶基因；乙烯；RACE；Real-timePCR；基因表达；

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