家蝇水通道蛋白克隆、鉴定及其功能的研究

家蝇水通道蛋白克隆、鉴定及其功能的研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-07-01 分类:期刊论文 喜欢:2559
师大云端图书馆

【摘要】背景家蝇(MuscaDomestic)是人类住所及其附近环境最常见的蝇类,是人类和动物的许多种病原体的传播载体。目前已经发现有100多种引起人类和动物的疾病的病原体与家蝇有关。它们包括霍乱、伤寒、细菌性痢疾、炭疽眼炎、结核、小儿腹泻和寄生蠕虫等。家蝇是公认的危害人类健康的害虫之一。家蝇同时也是法医昆虫学研究的一种重要蝇类。它主要用死亡时间的推断,同时在认定对儿童和老年人的虐待与漠视方面有比较高的价值。家蝇需要温暖的环境生存,在一个合适的温度范围内,环境温度越高其生长率就越高。但是在冬天的时候,家蝇就基本上绝迹,到次年春天温度上升后又大量出现,那么它们是怎么度过寒冷的冬季的呢?研究证实在冬天家蝇大部份都以蛆或者蛹的形态生存过冬。有研究结果提示水通道蛋白Aquaporin(AQP)可能跟昆虫耐低温有关,很可能是昆虫越冬的关键分子之一。AQP属于主要内在蛋白(MajorIntrinsicProtein,MIP)超家族成员,在多种昆虫中结构比较保守。以前对昆虫AQP的研究主要集中在它对内分泌的调控和对渗透压的调节这两个方面。但是对于AQP在家蝇中的表达模式和具体功能都尚未见报道。目的1、用分子生物学方法鉴定实验蝇种,为后续实验奠定基础。2、克隆家蝇AQP基因,为其表达模式研究奠定基础。3、筛选家蝇RT-qPCR内参基因,为AQP基因表达模式研究奠定基础。4、研究AQP在家蝇中的表达模式和AQP基因是否具有耐低温的功能。方法1.运用长链PCR方法结合Walkingprimer克隆家蝇线粒体DNA全序列,利用生物信息学法对家蝇进行分子种属的鉴定。2.运用RT-PCR方法和RACE技术家蝇AQP基因序列全长进行克隆。综合运用多种生物信息学在线软件对AQP基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸编码序列进行分析。3.运用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析在不同实验条件下,家蝇常见内参基因的稳定性,筛选出具体实验条件下稳定的内参基因,然后对实验数据进行标准化。4.运用荧光定量PCR方法检测AQP基因在家蝇成虫的头、胸和腹三部分以及家蝇成虫、卵、幼虫和蛹这四个不同发育阶段转录水平的相对表达量;运用原位杂交技术检测家蝇AQP基因mRNA在内脏中分布情况。5.运用RNA干扰技术沉默家蝇AQP基因的表达,然后通过抗低温实验验证AQP基因是否为家蝇耐低温的关键分子。结果1.家蝇接近mtDNA全长的序列已被其它研究人员抢先上传GenBank数据库(登陆号:EU154477),虽然只有绝大部分的序列,但是距全序列(约15200bp)仅差900bp。因此,我们迅速完成了实验室常规培养的棕尾别麻蝇和蛆症异蚤蝇的mtDNA序列全长测序和拼接等工作,并上传至GeneBank数据库,分别获得登陆号:KF921296和KF974742。这3种苍蝇的mtDNA序列结构组成跟大多数昆虫的mtDNA序列结构组成完全一致:它们的长度都在15000bp左右,包括13种编码蛋白的基因、22种tRNA、2种rRNA和一个非编码的A-T丰富区(通常被认为是控制区域)。生物信息学分析提示mtDNA序列全长能够有效的进行种属鉴定。2.成功克隆出家蝇AQP基因的全长序(GenBank登录号KJ599672),共1210bp,其中开放读码框序列738bp,编码245个氨基酸残基。与报道的其它昆虫的AQP基因序列有较高的保守性。具有6个跨膜结构域和典型的双NPA模序,属于两性通道(amphipathicchannel)是主MIP超家族成员。3.经GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件分析发现,在特定的实验条件下,家蝇内参基因稳定性不一,总体上,EF-1和RPS18比较稳定,可以作为本实验条件下的内参基因,对实验数据进行标准化。4.成虫AQP基因从头部到胸部最后到腹部含量越来越高。AQP基因在家蝇的卵、幼虫、蛹和成虫这四个不同的发育阶段都有表达。在蛹晚期表达量最低而卵期最高。成虫的表达量跟早期蛹表达量接近,而高于晚期蛹的表达量。在幼虫阶段,AQP基因的表达量从1龄期到3龄期逐渐下降,直到到蛹期化蝇前达到最低。原位杂交结果显示,AQP基因的mRNA在几乎整个内脏组织中都有表达,但是涎腺最为明显,其分布呈片或条带状,中肠组织也有零星的高表达。比较意外的是常见于其它昆虫表达的马氏管仅呈可疑阳性。5.在对家蝇三龄幼虫进行RNA干扰后的24hr、48hr和72hr,以未注射组相和注射无RNase水组为对照,注射dsRNA组的AQP基因表达水平在48hr和72hr时明显逐渐降低,这说明随着时间延长,dsRNA对家蝇AQP基因的表达起到了很好的的抑制效果。注射无RNase水组跟未注射组的表达量非常接近,这说明无RNase水对AQP基因表达没有明显影响。耐低温实验结果显示,3个处理组中的家蝇三龄幼虫在设定的实验条件下死亡个数很接近。经统计分析,组间差距没有统计学意义。结论1.首次从家蝇中克隆出水通道蛋白基因并首次获得棕尾别麻蝇与蛆症异蚤mtDNA序列全长。2.筛选出具体实验条件下最稳定的可以对实验数据进行标准化的内参基因,本实验中的EF-1和RPS18比较适合。3.首次成功的在家蝇幼虫体内建立了关于AQP基因的RNA干扰体系。4.在我们的实验中尚不能证实AQP基因是家蝇幼虫耐低温的关键分子。
【作者】钟鸣;
【导师】文继舫;
【作者基本信息】中南大学,基础医学,2014,博士
【关键词】(3-8)线粒体DNA;RT-qPCR;RACE;生物信息学;原位杂交;砒妊干扰;表达模式;耐低温;

【参考文献】
[1]张喜玲.高中语文新教材批判[D].湖南师范大学,教育,2004,硕士.
[2]黄李沁心.中国家族企业非效率投资及其动因分析[D].浙江工商大学,会计学,2014,硕士.
[3]朱春奎.氧化钛基光阳极薄膜的制备及性能测试[D].陕西科技大学,2014.
[4]沈琼斐.刘家峡黄河特大桥锚碇大体积混凝土温控研究[D].兰州理工大学,结构工程,2013,硕士.
[5]胡杨.饮酒影响共情的脑机制:来自功能磁共振成像的证据[D].华东师范大学,基础心理学,2013,硕士.
[6]马神洲.不同射频消融方法治疗房颤的远期效应:meta分析[D].山东大学,内科学(专业学位),2013,硕士.
[7]徐兴尧.科技新株绽花蕾[J].汽车维修.1995(01)
[8]潘双吉.奥巴马执政以来中美应对气候变化合作分析[D].辽宁大学,国际关系,2012,硕士.
[9]周海.基于性别差异的普通高校体育舞蹈教学实验研究[D].西南交通大学,体育教育训练学,2014,硕士.
[10]张恒.重庆乾嘉道惩恶治吏研究[D].重庆大学,法律史,2014,硕士.
[11]张超.高中数学课堂学生提问行为的研究[D].贵州师范大学,学科教学(专业学位),2014,硕士.
[12]张慧.图式理论视角下的《还乡》中译本研究[D].四川外国语大学,英语语言文学,2013,硕士.
[13]崔宝玉,谢煜.农民专业合作社:“双重控制”机制及其治理效应[J].农业经济问题,2014,06:60-67+111-112.
[14]张小辰,程浩忠,SantiagoGRIJALVA,BazarganMASOUD.一种基于Kron简化的跨区域可用传输能力分布式算法[J].电力系统自动化,2013,18:68-74.
[15]朱孔严.临沂市数字化城市管理模式架构及实施策略研究[D].西安科技大学,工商管理,2013,硕士.
[16]陈革.我国上市公司换股并购研究及案例分析[D].首都经济贸易大学,会计学,2004,硕士.
[17]丁小凤.生物分子功能化的纳米材料在重金属微污染物痕量分析中的研究[D].安徽大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[18]尹文纲.艾灸治疗膀胱过度活动症随机对照研究[D].北京中医药大学,针灸推拿学,2014,硕士.
[19]郭洪娜.网络化数字视频监控系统的研究与开发[D].武汉理工大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[20]陈圣明.基于PDM木工机械数字化设计系统的研究及应用[D].广东工业大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[21]崔河,刘越.离子型共聚酯及其共混物的流变行为[J].山东纺织经济.2004(04)
[22]杨广峰.赤峰硕丰畜禽食品有限公司食品冷链物流绩效评价研究[D].吉林大学,交通运输工程,2014,硕士.
[23]张苗.基于模型的软件测试用例自动生成的研究[D].吉林大学,软件工程,2013,硕士.
[24]崔岩菲.水处理多级絮凝耦合关系研究[D].山东建筑大学,市政工程,2013,硕士.
[25]杨阳.浅谈潘天寿艺术中的民族精神[D].曲阜师范大学,美术学,2013,硕士.
[26]陈雪芳,黄英,黄海舰,王科.锂离子电池用硅负极材料的研究进展[J].中国科技论文,2014,09:1070-1074.
[27]吴健生,王家林.用高阻方向滤波器提高低磁纬度地区磁异常化极效果[J].石油地球物理勘探,1992,05:670-677+694.
[28]徐金凤.论我国未成年人前科消灭制度之构建[D].北京交通大学,2014.
[29]赵跃.JTIDS信号的高效信道化接收及检测技术[D].杭州电子科技大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[30]于涛.东亚区域经济合作与我国的战略对策[D].吉林大学,世界经济,2004,硕士.
[31]宋阿丽.印尼华文补习学校(班)华文教育现状调查研究[D].北京师范大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[32]尹志恒,狄帮让,魏建新,张征,张四海,吴满生.裂缝参数对纵波能量衰减影响的物理模型研究[J].石油地球物理勘探,2012,05:728-734+753+844+677.
[33]李峻.武汉城市圈“两型社会”建设研究[D].辽宁大学,区域经济学,2014,博士.
[34]任冬梅.猪肺炎支原体168株疫苗候选抗原蛋白Mhp168_116、Mhp168_341、Mhp168_322和Mhp168_549的原核表达及纯化[D].西南大学,预防兽医学,2014,硕士.
[35]李擎,张超,陈鹏,尹怡欣.一种基于粒子群参数优化的改进蚁群算法[J].控制与决策,2013,06:873-878+883.
[36]王源湲.太原市城市居民最低生活保障制度运行研究[D].山西财经大学,社会保障,2013,硕士.
[37]柳婷.突发事件中政府信息公开与政府信任实证研究[D].西南交通大学,行政管理,2014,硕士.
[38]陶苏.农村商业银行经营绩效及其影响因素分析[D].南京农业大学,工商管理,2013,硕士.
[39]邓英东.证券投资有效边界的研究[D].合肥工业大学,计算数学,2003,硕士.
[40]赵立.便携消光式烟度仪的研究[D].天津大学,动力机械及工程,2004,硕士.
[41]朱明.环境绩效评估及其影响因素研究[D].浙江理工大学,产业经济学,2014,硕士.
[42]赵丽佳.柔性染料敏化电池的制备、结构及功能特性研究[D].沈阳建筑大学,材料物理与化学,2012,硕士.
[43]陈英雄.机器人磨削个性化人工髋关节方法和实验研究[D].厦门大学,测试计量技术及仪器,2014,硕士.
[44]邱胤轩.Versatic10/Mextra1984H萃取分离废水中的铜镍钴锌镉的研究[D].北京有色金属研究总院,有色金属冶金,2014,硕士.
[45]陶然.镍基催化剂上间-二硝基苯加氢反应研究[D].天津大学,工业催化,2004,硕士.
[46]王阳洋.颅脑外伤患者躁动的原因及镇静镇痛研究[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[47]方原柏.均速管流量计的设计和选用[J].冶金自动化,1990,04:26-30.
[48]张斌.基于利贫增长的农村土地政策改进研究[D].兰州大学,土地资源管理,2013,硕士.
[49]柴旭峥,梁曦东,曾嵘,何金良.串联补偿的远距离输电线路潜供电弧参数特性[J].电力系统自动化,2007,05:7-12+56.
[50]毛志娟.房地产供需分析的State space-Cobweb模型构建及应用研究[D].南京财经大学,数量经济学,2013,硕士.

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