PI3K-Akt和JNK信号通路与AfMNPV诱导斜纹夜蛾SL-1细胞凋亡

【摘要】细胞凋亡是由胞内基因控制的程序死亡过程,即多细胞生物在生理或病理条件下,经过多途径的信号传导作用而启动内部机制,结束其自身生命的过程。目前人们对于细胞凋亡途径的研究已经进行了一个漫长的过程,由于细胞中的信号转导通路在细胞周期、增殖分化与凋亡以及多种生命活动中的重要调节作用亦愈来愈受人重视,因此关于细胞凋亡与细胞信号转导通路间的关系的研究也相继开展起来。JNK信号转导通路是MAPK通路的一重要分支,或称为应激活化蛋白激酶,它在细胞周期、凋亡和细胞应激等多种生理和病理过程中起重要作用；PI3K信号通路通过参与多种细胞生命活动尤其是调节肿瘤细胞的增殖和存活而受到人们的重视,其中AKT也称为蛋白激酶B(PKB),是PI3K下游主要的效应物,活化的AKT通过磷酸化多种酶、激酶或转录因子来调节细胞的功能。关于以上所述的细胞凋亡与细胞信号转导通路关系的研究基本是在哺乳动物细胞中展开,本实验室长期从事昆虫细胞凋亡的研究,前期的实验已经证实了AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡的过程中涉及到线粒体凋亡途径,细胞色素C从胞间质释放到胞质中后引起下游的一系列复杂的凋亡级联反应。本实验拟在此基础之上,探究JNK和PI3K-AKT信号通路与AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡的过程间是否也存在某种联系。SP600125和Wortmannin分别是JNK和PI3K-AKT信号通路的特异性抑制剂,实验之前我们对实验细胞SL-1进行了两种抑制剂的耐受性实验,发现SP600125和Wortmannin在浓度低于50μM时,对SL-1的生长基本无毒害用。首先为了更好地了解SL-1细胞在各种条件下的细胞动力学过程,实验中采用血细胞板法计数细胞,绘制它的生长曲线,发现正常培养条件下的SL-1细胞成简单的“S型”生长,当分别加入这两种最适浓度的抑制剂SP600125(2.5μM)和Wortmannin(0.5μM)培养细胞后,SL-1的生长趋势不变,因此后续实验中的抑制剂也是采用这两种浓度。在荧光显微镜下从形态学上定性的观察DAPI染色的SL-1细胞,发现经SP600125和Wortmannin分别处理的AfMNPV诱导后的SL-1细胞,凋亡小体明显减少；流式细胞术定量的测量细胞凋亡率的结果与之一致,抑制剂组的细胞凋亡程度明显较病毒组低,因此初步可以判定JNK和PI3K信号通路参与了AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡的过程。接下来研究采用caspase-3酶活的测定以及WesternBlot方法检测凋亡相关蛋白的表达,试图探究JNK和PI3K-AKT信号通路如何影响AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡过程。实验结果表明,AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡后,caspase-3酶活增强且被活化切割成17KD片段,启动了下游的凋亡事件,但是当分别或同时加入抑制剂SP600125和Wortmannin后,caspase-3的切割大幅度减弱,凋亡程度明显被抑制,其中同时使用两种抑制剂的效果和单独使用抑制剂时区别不大。于是对凋亡上游事件细胞色素C的变化情况进行检测,和预测结果一致,在加入抑制剂SP600125和Wortmannin后胞质中细胞色素C含量显著下降,这就说明在AfMNPV诱导SL-1细胞凋亡的起始阶段,JNK和P13K信号转导通路即被活化参与到整个凋亡进程中。在哺乳动物细胞中发现编码JNK的基因：jnk1、jnk2、jnk3,其相应的编码产物JNKl和JNK2广泛存在于各组织中,当JNK通路被激活,相应的蛋白JNKl和JNK2会发生磷酸化进而发挥功能。当用免疫印迹杂交的方法检测JNKl/2和P13K的关键效应物AKT蛋白的表达情况,发现AfMNPV是通过磷酸化JNKl/2和AKT来分别激活了JNK和PI3K-AKT信号通路并且影响了SL-1细胞周期,但是所有这些蛋白的磷酸化程度在分别加入SP600125和Wortmannin后相应的减弱。实验结果显示无论是被活化切割的caspase-3蛋白还是JNK和P13K信号通路的效应物P-JNK1/2和P-AKT,蛋白含量都随病毒诱导凋亡时间的延长而增加。因此初步可以得出结论,JNK和PI3K-AKT信号通路通过活化JNKl/2和AKT蛋白而参与到AfMNPV诱导的SL-1细胞凋亡过程中,协同调节各种凋亡反应并且影响细胞周期的改变。
【作者】孙瑶瑶；
【导师】彭建新；
【作者基本信息】华中师范大学，农业昆虫与害虫防治，2014，硕士
【关键词】细胞凋亡；Caspase；JNK；PI3K-AKT；斜纹夜蛾；

【参考文献】
[1]梁俊虎.模拟电路仿真中建模技术研究[D].北方工业大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[2]吴江.无机纳米材料Sm/Ag/TiO_2的表征、光催化性及抗菌性能研究[D].佳木斯大学,口腔医学（专业学位）,2014,硕士.
[3]刘畅.地方政府政务微博的传播效应研究[D].大连理工大学,传播学,2013,硕士.
[4]王婉.论行政垄断的反垄断法规制[D].云南财经大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[5]刘惠.知识发现理论与方法及其应用的研究[D].大连理工大学,2004.
[6]易桃利.有限责任公司股权外部转让限制条件研究[D].广东财经大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[7]鱼爱梅.新时期中国廉政文化建设研究[D].延安大学,马克思主义哲学,2014,硕士.
[8]郭爽.水介质中原子转移自由基聚合法制备SiO_2复合粒子的研究[D].大连工业大学,材料学,2008,硕士.
[9]施图万,陈建辉,吴孝松,俞大鹏.蓝宝石上石墨烯的近程催化生长研究[J].电子显微学报,2013,05:365-371.
[10]朱立瑞.群智能优化算法及其在路由优化策略中的应用[D].吉林大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[11]韩玉.土耳其新外交政策浅析[D].河北师范大学,国际政治,2014,硕士.
[12]吴静.我国上市公司治理结构与公司绩效关系的实证研究[D].宁波大学,企业管理,2013,硕士.
[13]杨浩春,陈禧平.关于开行天津市环状铁路公交列车问题[J].中国铁路.1999(10)
[14]黄玉萍.巴林右旗的土地改革运动[D].内蒙古师范大学,中国近现代史,2012,硕士.
[15]周焰,李德仁.基于两步策略的形状检索[J].控制与决策,2004,03:355-357.
[16]鞠永辉.长春地区公共图书馆总分馆制协作模式研究[D].吉林大学,图书馆学,2014,硕士.
[17]彭云.危险化学品事故应急设施选址研究[D].北京化工大学,应用数学,2013,硕士.
[18]邹成刚.仿生复眼的光学设计与模拟仿真[D].天津大学,光学工程,2013,硕士.
[19]李超.高压大功率高频DC-DC变换器研究[D].北京交通大学,2015.
[20]夏前芳,黄颖娟,杨雪,李在均.新型石墨烯/金/功能导电高分子/过氧化氢生物传感器的制备及应用[J].化学学报,2012,11:86-92.
[21]柴文莉.企业职工基本养老保险延迟退休制度研究[D].郑州大学,社会保障,2013,硕士.
[22]孙蓉.南瓜叶蛋白的分离及其产物的生理功能评价[D].西南大学,食品科学,2013,硕士.
[23]宋金鸿.背景知识对外语学习者在即时作文测试中表现的影响[D].首都师范大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[24]李弦音.基于自组织理论的物联网家电的产品系统和设计研究[D].江南大学,设计艺术学,2012,硕士.
[25]边培军.基督教生态伦理思想初探[D].山西大学,外国哲学,2004,硕士.
[26]郭巨,高成章.新型乳化液吹扫及抽吸设备的应用[J].一重技术.2007(06)
[27]谢志华,张庆龙,袁蓉丽.董事会结构与决策效率[J].会计研究,2011,01:31-37.
[28]艾恕.世界光通信市场近期动向综述[J].世界电信.2006(09)
[29]黄党委.梨树断陷隐蔽油气藏主控因素研究[D].东北石油大学,地质工程（专业学位）,2013,硕士.
[30]周进生.明清画谱画诀初步研究[D].中国艺术研究院,美术学,2004,硕士.
[31]银燕.行政生态环境在县域经济发展中的作用研究[D].东北师范大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[32]季冬兰,孟勇,张勇,吴兆宇.挖掘场地条件创造人性化滨水空间——成都市武侯区江安河绿化观光休闲公园规划设计[J].技术与市场.园林工程.2005(01)
[33]刘洁.智能业务终端网络协议模块的研究与设计[D].河北科技大学,计算机技术,2012,硕士.
[34]王庆双.归脾汤对抑郁模型大鼠脑内CRH、BDNF影响的实验研究[D].黑龙江中医药大学,方剂学,2013,硕士.
[35]徐晨.泡沫铅的制备及其对铅酸电池性能的影响[D].南京航空航天大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[36]龚娜.论左翼文化运动对马克思主义传播的贡献[D].吉林大学,中共党史,2014,硕士.
[37]杨成.大跨柱面屋盖围护结构极值风压与设计风荷载[D].北京交通大学,2014.
[38]王子刚.产业集聚与城市化互动关系研究[D].东北师范大学,区域经济学,2012,硕士.
[39]李敏.基于高程熵的地形匹配算法研究[D].西安电子科技大学,计算机应用技术,2011,硕士.
[40]胡冰.次血红素短肽化合物体外稳定性研究[D].吉林大学,微生物学与生化药学,2014,硕士.
[41]李陆美.建筑物外立面图像校正技术研究[D].中国地质大学（北京）,电子与通信工程,2013,硕士.
[42]王薇琳.论制播分离对提升电视节目质量的意义——以“中国好声音”为例[J].现代视听,2014,04:10-15.
[43]岳瑾明.久大精盐公司发展的社会环境研究（1914-1936）[D].河北师范大学,中国近现代史,2012,硕士.
[44]崔卜心.多源检测数据提升养护效能研究[D].长安大学,道路与铁道工程,2014,硕士.
[45]韩玉龙.安县泥石流危险性评价及防治的数值模拟[D].吉林大学,防灾减灾工程及防护工程,2013,硕士.
[46]李玉.从分裂到整合：《金色笔记》中安娜的心理分析解读[D].湖南师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[47]王晓庆.磁光调制型旋光仪的原理与应用研究[D].上海理工大学,光学工程,2012,硕士.
[48]桂卫华,毛友志.PLC在氧化锌晶须加工中的应用[J].冶金自动化,2007,01:61-65.
[49]胡洋.福建东南沿海地区地壳形变特征及地幔动力学分析研究[D].长安大学,大地测量学与测量工程,2014,硕士.
[50]高飞.关联规则挖掘算法研究[D].西安电子科技大学,2001.