巴西橡胶树HSP70基因的克隆与表达分析

【摘要】热休克蛋白70(Heatchockprotein,HSP70)是研究最广泛,并且已证明在植物细胞应答极端环境过程中发挥重要作用的蛋白质。在植物细胞遭受外界环境胁迫时,HSP70发挥其分子伴侣的功能,阻止细胞内非正常折叠的蛋白质降解,并协助其重新折叠成正常的蛋白质。此外,HSP70也参与蛋白质翻译和转运过程,在维持生物体的生命过程及生长发育过程中发挥重要作用。但是目前关于橡胶树HSP70的研究还比较匮乏,因此,克隆橡胶树HSP70基因,了解其表达调控特点,特别是它们与橡胶树非生物胁迫应答和逆境耐受能力的关系,将有助于阐述橡胶树胁迫应答的生理调节机制,具有重要的理论意义和应用前景。本文克隆了两个巴西橡胶树HSP70基因,进行了系统的表达特性分析,并初步探讨了它们的生物学功能。主要研究结果如下：1.搜索橡胶树胶乳EST序列数据库,获得2个橡胶树HSP70基因的EST拼接序列(contig),设计特异引物,运用PCR和RACE技术,克隆了两个巴西橡胶树HSP70蛋白基因的全长cDNA,分别命名为HbHSP70-1和HbHSP70-2。HbHSP70-1基因编码572个氨基酸,HbHSP70-2基因编码664个氨基酸。生物信息学预测显示：HbHSP70-1为疏水蛋白,HbHSP70-2为亲水蛋白,其中HbHSP70-2蛋白的N端具有信号肽,可能是一种分泌性蛋白。2.克隆了HbHSP70-1和HbHSP70-2基因的5’启动子调控序列,长度分别为1887bp和2315bp。分析表明,HbHSP70-1和HbHSP70-2的启动子序列中均包含真核生物典型的核心启动子区域,同时还包含多种胁迫相关的调控元件,部分调控元件的功能已经在HbHSP70-1和HbHSP70-2基因的表达分析中得到了验证。3.克隆了HbHSP70-1和HbHSP70-2的基因组序列,长度分别为1719bp和3263bp,其中HbHSP70-1的基因组序列没有内含子,而HbHSP70-2的基因组序列包含8个外显子和7个内含子。4.实时荧光定量(qRT-PCR)分析结果表明：HbHSP70-1和HbHSP70-2基因的组织表达模式存在明显的差异,且均在种子中的表达丰度较高；HbHSP70-1在乙烯利刺激和伤害处理下呈下调表达,但是受割胶和死皮影响不明显；而HbHSP70-2在割胶处理下呈下调表达,随死皮程度增加呈上调表达,但是受乙烯利刺激和伤害处理的影响不明显。高温处理条件下,两个HbHSP70基因在橡胶树根、树皮和叶片中的表达均受到显著诱导,上调幅度高达5-160倍；低温处理条件下,两个HbHSP70基因在橡胶树根中的表达也受到显著诱导,在树皮中则均呈现先上调后下调的表达模式,在叶片中两个HbHSP70基因的表达模式有所不同,HbHSP70-1基因呈先下调后恢复的表达模式,而HbHSP70-2基因则先上调后缓慢下调的表达模式；干旱处理条件下,同一HbHSP70基因在不同组织中以及不同HbHSP70基因在同一组织中的表达模式均存在明显差异。5.实现了HbHSP70-1和HbHSP70-2两基因在E.coli中的表达,并确定了它们在大肠杆菌中各自最适的诱导表达条件。6.在高温胁迫的实验条件下,过表达HbHSP70-1的E.coli重组菌株的生长速度比对照菌株快,而过表达HbHSP70-2的E.coli重组菌株的生长速度比对照菌株慢。
【作者】曹冰；
【导师】唐朝荣；
【作者基本信息】海南大学，发育生物学，2014，硕士
【关键词】巴西橡胶树；热休克蛋白70；基因克隆；表达分析；胁迫应答；

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