草果抑菌活性物质作用机制及分离纯化的研究

【摘要】本研究对草果抑菌物质的提取工艺和作用机制进行了研究,对有效成分进行分离纯化,获得了微波-超声波协同萃取的最适工艺参数,明确草果抑菌物质的作用机制,并筛选高效抑菌成分,为草果天然食品防腐剂的开发提供了依据。本论文采用单因素试验法和响应面法优化草果抑菌物质提取工艺,采用液-液分离法对草果粗提物进行梯度萃取,通过考察草果萃取物对供试菌的最小抑菌浓度(MIC),对生长曲线的影响,对培养液电导率、蛋白质和还原糖含量的影响,对细胞呼吸速率及细胞形态的影响来确定草果萃取物的抑菌作用机制,采用硅胶柱层析,薄层层析对草果抑菌物质进行分离纯化,通过抑菌活性试验,筛选得到高效抑菌成分,并进行了气相色谱-质谱(GC-MS)分析。试验结果如下：1.选取浸泡时间、乙醇浓度、液料比、超声微波提取温度、超声微波提取时间等五个因素,通过单因素试验法和响应面法对草果抑菌物质提取工艺进行优化,以抑菌圈为指标,得最佳提取工艺为：浸泡时间20h,乙醇浓度65%,液料比25：1(m1/g),超声微波提取温度57.5℃,超声微波提取时间52.5min,对金黄色葡萄球菌抑菌圈为14.2mm。2.采用液-液分离法对草果粗提物进行梯度萃取,得石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物。草果萃取物对供试菌MIC的测定结果为：石油醚萃取物对金黄色葡萄球菌的MIC为2.5mg/ml,对大肠杆菌的MIC为5mg/ml;氯仿萃取物对金黄色葡萄球菌的MIC为1.25mg/ml,对大肠杆菌的MIC为2.5mg/ml;乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌的MIC为1.25mg/ml,对大肠杆菌的MIC为1.25mg/ml;正丁醇提取物对金黄色葡萄球菌的MIC为5mg/ml,对大肠杆菌的MIC为5mg/ml.3.草果萃取物对供试菌生长曲线的影响试验结果表明,草果萃取物能够不同程度的缩短供试菌的对数生长期,菌体数量增长减缓。其中,对金黄色葡萄球菌的抑制能力依次为：乙酸乙酯萃取物>氯仿萃取物>石油醚萃取物>正丁醇萃取物；草果萃取物对大肠杆菌的抑制能力依次为：乙酸乙酯萃取物>氯仿萃取物>正丁醇萃取物>石油醚萃取物。4.草果萃取物对供试菌培养液电导率影响的试验结果表明,草果萃取物可以不同程度的提高供试菌培养液的电导率值,使细胞膜通透性增加。其中,草果萃取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的影响能力依次为：乙酸乙酯萃取物>氯仿萃取物>石油醚萃取物>正丁醇萃取物。5.草果萃取物对供试菌培养液蛋白质含量的影响试验结果表明,乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球和大肠杆菌的影响最明显,蛋白质含量明显上升,终浓度分别为863ug/ml和811ug/ml.氯仿萃取物其次,蛋白质终浓度为801ug/ml和751ug/m.6.草果萃取物对供试菌培养液还原糖含量的影响试验结果表明,乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球和大肠杆菌的影响最明显,还原糖含量明显上升,终浓度分别为16.5mg/ml和16mg/ml.氯仿萃取物其次,还原糖浓度为14.5mg/ml和13.4mg/ml.7.草果萃取物对细胞呼吸速率的影响试验结果表明,以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为供试菌,通过测定培养液含氧量,得出草果萃取物与三种典型抑制剂一样,均能抑制细胞呼吸速率。草果萃取物与丙二酸叠加率最小,表明其主要是通过糖代谢的三羧酸循环途径抑制细胞呼吸,阻碍细胞的生长繁殖。8.采用扫描电镜,研究草果萃取物对细胞形态的影响试验结果表明,草果萃取物对供试菌细胞膜影响较大,乙酸乙酯萃取物作用8h时,金黄色葡萄球菌细胞间大片粘连,细胞膜变得模糊。乙酸乙酯萃取物和氯仿萃取物在作用4h时,大肠杆菌细胞出现破碎、断裂等现象,8h时更加严重。9.采用加压硅胶柱对抑菌效果最好的乙酸乙酯萃取物进行分离纯化,通过抑菌筛选,选取抑菌效果较好的EA-1-6,EA-3-1,EA-3-2,EA-3-3四个流分,进行GC-MS分析。其中,EA-1-6流分含有百里香素(1.34%)、邻苯二酚(62.86%)等抑菌成分；EA-3-1流分含有麦芽醇(8.7%)、2-(丁烯基)-4-羟基-3-甲基-2-环戊烯-1-酮(1.54%)、油酸酰胺(4.13%)等抑菌成分；EA-3-2流分所含主要成分有：四氢哒嗪(5.02%)、麦芽醇(8.62%)、油酸酰胺(4.28%)等抑菌成分；EA-3-3流分所含主要成分有：诱杀烯醇(9.34%)、2-乙酰环戊酮(2.32%)、匙叶桉油烯醇(4.46%)、油酸酰胺(3.69%)等抑菌成分。
【作者】彭美芳；
【导师】仇厚援；陈文学；
【作者基本信息】海南大学，食品科学，2014，硕士
【关键词】草果；超声微波提取；抑菌机理；分离纯化；GC-MS分析；

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