TLR4通过增强TGF-β/Smad信号通路介导前列腺增生上皮细胞EMT的机制研究
【摘要】[研究背景]良性前列腺增生(benignprostatichyperplasia,BPH)是老年男性的常见和多发性疾病。随着人们生活水平的提高和人均寿命的延长,其发病率正逐年上升。年龄的增长和有功能睾丸的存在是BPH发病的必要条件,但其发病机制尚不明确。近年来,前列腺炎症在BPH发病机制中的重要作用已引起了众多关注,有学者提出BPH是一种免疫介导的炎性疾病。Toll样受体4(Tolllikereceptors4,TLR4)是LPS的受体,在机体应对病原微生物的先天性免疫反应中发挥着关键作用。TLR4不仅在各种免疫细胞上表达,还在各种上皮和内皮细胞大量表达,作为机体先天性免疫的第一道防线。有文献报道,TLR4信号可能参与前列腺上皮细胞EMT的发生,从而促进前列腺疾病的发生和进展。转化生长因子β1(Transforminggrowthfactor-β,TGF-β1)是一种多效性细胞因子,参与细胞重构过程,如细胞增殖、凋亡、分化及迁移。骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制剂(BMPandactivinmembrane-boundinhibitor,BAMBI),作为TGF-β信号通路伪受体,可以与TGF-βI型受体竞争,阻止I型与II型受体及配体结合成功能性复合物,从而阻断TGF-p信号的传递。关于BAMBI蛋白在人体各组织的表达已有文献报道。然而,关于BAMBI蛋白在人体前列腺增生组织中的具体表达情况却很少有文献报道。上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是指上皮细胞失去极性,表现出迁移能力增强,在细胞基质间能够自由移动且呈现间质细胞表型的转化过程。研究发现,在BPH组织,部分上皮细胞失去E-cadherin蛋白表达,同时获得Vimentin蛋白表达,提示BPH发生发展过程中间质细胞的积累可能来源于前列腺上皮细胞。TGF-β1被认为是诱导上皮细胞发生EMT的关键因子,尽管TGF-β信号通路相对较简单,但其调节机制却十分复杂。目前,TGF-p信号通路的调控及其与其他信号通路的关系已成为一个新的研究热点。为了探讨LPS/TLR4、BAMBI及TGF-β/Smad信号通路在前列腺增生EMT过程中的信号转导及相互作用机制,我们首先运用免疫组化及免疫荧光双染技术检测了TLR4、BAMBI、p-Smad2/3在BPH组织中的表达及共定位。然后运用实时定量PCR、Western-blot及免疫组化技术检测了LPS及TGF-β1刺激后BPH-1细胞EMT各项指标的表达情况,研究TLR4增强TGF-β-EMT信号通路的作用。最后运用腺病毒转染技术构建BAMBI高表达及低表达的BPH-1细胞系,探讨TLR4通过下调BAMBI增强TGF-β/Smad-EMT信号通路的作用机制,为BPH的发病机制提供新的思路。[方法与结果]1.TLR4、p-Smad2/3在合并炎症的BPH组织中表达水平显著上调：采用免疫组化检测62例BPH组织中TLR4、BAMBI及p-Smad2/3的表达,结果发现在合并炎症的47例BPH组织中TLR4及p-Smad2/3的表达显著高于未合并炎症的15例BPH组织,而BAMBI在合并炎症及未合并炎症的BPH组织中表达无显著性差异(P<0.05)。2.在合并炎症的BPH组织中,TLR4与BAMBI表达呈负相关,与p-Smad2/3表达呈正相关：采用Spearman相关分析研究TLR4、BAMBI及p-Smad2/3在BPH组织中表达的相关性。结果发现,在单纯BPH中,TLR4与BAMBI、p-Smad2/3表达均无直线相关(r=-0.152、0.099,P=0.108,0.240),BAMBI与p-Smad2/3蛋白表达呈弱的负相关(r=-0.298,P=0.041)。在合并炎症的BPH中,TLR4与BAMBI表达呈负相关(r=-0.533,P=0.007),TLR4与p-Smad2/3表达呈正相关(r=0.308,P=0.015),BAMBI与p-Smad2/3表达呈负相关(r=-0.612,P=0.004)。3.TLR4与BAMBI.TLR4与p-Smad2/3在BPH组织中共表达：采用免疫荧光双染的细胞共定位技术检测BPH组织中TLR4与BAMBI、TLR4与p-Smad2/3的同步表达和定位。结果发现,在BPH组织中,特别是BPH上皮细胞中可以观察到TLR4与BAMBI、TLR4与p-Smad2/3的同步表达和定位。4.LPS/TLR4通过增强TGF-β/Smad信号通路诱导BPH-1细胞发生EMT：选取BPH-1细胞株作为研究对象,免疫组化检测发现BPH-1细胞表达TLR4及BAMBI,且在LPS刺激后TLR4表达上调、BAMBI表达下调,但p-Smad2/3表达阴性。采用实时定量PCR、Westernblot及免疫组化检测各组EMT通路下游指标的表达,结果显示,lOug/mlLPS+0.1ng/mlTGF-β1作用组E-cadherin的mRNA及蛋白表达显著低于空白对照及阴性对照组(P<0.05),Vimentin及p-Smad2/3的mRNA及蛋白表达显著高于空白对照及阴性对照组(P<0.05)。加入TLR4阻断剂CLI-095后,lOug/mlLPS+0.1ng/mlTGF-β1下调E-cadherin及上调Vimentin、p-Smad2/3的作用被抑制(P<0.05)。5.LPS/TLR4信号下调BPH-1细胞BAMBI的表达：运用实时定量PCR、WesternBlot及免疫组化染色的方法检测LPS刺激后BPH-1细胞BAMBI蛋白的表达变化。结果发现,LPS作用组BAMBI的mRNA及蛋白表达含量显著低于空白对照组及LPS+CLI-095共同作用组(P<0.05)。6.TLR4通过下调BAMBI增强TGF-β/Smad-EMT信号通路：采用腺病毒转染技术,构建了BAMBI蛋白低表达(AddnBambi)与过表达(AdBambi)的BPH-1细胞系,以未转染BPH-1细胞作为空白对照。采用实时定量PCR、Westernblot及免疫组化检测各组EMT通路下游指标的表达。结果显示,在lOug/mlLPS+O.lng/mlTGF-β1作用后,AdBambi组的p-Smad2/3及Vimentin表达显著低于空白对照组,E-cadherin表达显著高于空白对照组(P<0.05),而AddnBambi组的p-Smad2/3、E-cadherin及Vimentin表达与空白对照组无显著性差异(P>0.05)。[结论]1.在合并炎症的BPH组织,TLR4及p-Smad2/3的表达显著上调,提示TLR4及TGF-β/Smad信号通路可能参与炎症促进BPH的发生和发展过程。2.在合并炎症的BPH组织中,TLR4与BAMBI表达呈负相关,与p-Smad2/3表达呈正相关,且TLR4与BAMBI、TLR4与p-Samd2/3在BPH组织上皮细胞共表达,提示TLR4与TGF-β/Smad信号通路之间可能通过BAMBI存在信号的交流。3.人前列腺增生上皮BPH-1细胞可以表达TLR4及BAMBI蛋白,不表达p-Smad2/3蛋白,且在LPS作用后TLR4表达上调、BAMBI表达下调,提示TLR4信号可能下调BAMBI表达。4.LPS/TLR4可以通过增强TGF-β/Smad信号途径诱导BPH-1细胞发生EMT。5.通过腺病毒转染技术可以构建BAMBI过表达及低表达的BPH-1细胞系,过表达BAMBI可以抑制BPH-1细胞发生EMT。提示LPS/TLR4信号可以通过下调BAMBI蛋白的表达,增强TGF-β/Smad信号通路诱导BPH-1细胞发生EMT的作用。
【作者】何垚；
【导师】陈湘；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】BPH-1细胞；TLR4；转化生长因子-β1；BAMBI；上皮间质转化；
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