斜纹夜蛾细胞Spli Apaf-1蛋白在细胞凋亡过程中作用机制的初步研究

【摘要】细胞凋亡通路的研究受到科学工作者的广泛关注,并且取得了众多成果。目前研究的较为透彻的是在线虫、果蝇和人类中的细胞凋亡通路,由于细胞凋亡事件在进化过程中的保守性,它们存在着许多相似的地方,但也有许多进化上的分歧引发的不同。最具保守性的是内源性线粒体凋亡通路,以哺乳动物为例,当细胞发生凋亡时,细胞色素C从线粒体的内外膜间质释放到细胞质中,跟位于细胞质中的Apaf-1结合引起其聚合形成凋亡体复合物,继而募集起始Caspase9酶原并活化形成一个大型的蛋白水解机器,切割活化效应Caspase引起凋亡的级联反应。然而在对鳞翅目昆虫凋亡通路的研究中却发现了与进化上相近的果蝇凋亡通路中相左事件,即内源性通路起始因子细胞色素C在该通路中是否参与的问题。凋亡体复合物是内源性线粒体通路的中心,而其组装亚单位Apaf-1更是该通路的核心蛋白,对鳞翅目昆虫Apaf-1的研究将为进一步揭示昆虫细胞凋亡通路的分子机制提供条件。本研究首先制备了斜纹夜蛾细胞Apaf-1蛋白的多克隆抗体,并运用该抗体对Apaf-1蛋白的功能进行初步研究。根据本实验室获得的斜纹夜蛾Apaf-1SNP序列,选取其中一段编码147个氨基酸的保守序列作为目的片段,构建原核表达载体pET22b-Apaf1N147,表达并纯化融合蛋白His-Apaf1N147,免疫兔子制备多克隆抗血清,然后以亲和层析的方法纯化所获得的抗血清并通过Westernblot检测。结果表明,制备并纯化后的抗体可以特异性结合原核表达的Apaf-1抗原蛋白和斜纹夜蛾内源的Apaf-1蛋白。斜纹夜蛾Apaf-1兔多克隆抗体的制备,为进一步研究鳞翅目昆虫Apaf-1蛋白的结构和功能提供了有力的条件；同时,我们也提出了一个快速高效纯化多克隆抗体的方案。通过免疫荧光,我们利用所制备的Apaf-1兔多克隆抗体以及带有FITC标签的荧光二抗,以BSA作为对照间接地鉴定了这个蛋白在斜纹夜蛾细胞中的定位,结果显示它定位在胞质中。为了更进一步研究Apaf-1蛋白在鳞翅目昆虫凋亡通路中的作用,需要将该蛋白的ORF正确地扩增出来并外源表达。我们通过改变扩增体系中Mg2+浓度和退火温度以高保真KOD酶最终经过双轮PCR获得了Apaf-1的ORF全长,将其连接到原核表达载体上进行原核表达尝试,结果未获得完整正确表达的Apaf-1蛋白。之后我们构建真核表达载体pIE1-Apaf-1-EGFP并将构建好的真核表达载体转染进处于对数生长期的斜纹夜蛾细胞中,并在荧光显微镜下观察,结果发现外源的融合蛋白Apaf-1-GFP在斜纹夜蛾细胞中得以表达并且表达了的融合蛋白定位在细胞质当中,这与免疫荧光实验的结果相一致。用免疫共沉淀技术通过抗原抗体之间相互作用以及ProteinG与抗体IgG之间特异的相互作用将斜纹夜蛾胞质蛋白中能够与CytoC相互作用的Apaf-1蛋白沉淀下来并通过westernblot检测；用pull-down技术通过挂在Ni-NTA树脂上的原核表达的融合蛋白His-CytoC将斜纹夜蛾胞质蛋白中能与细胞色素C相互作用的Apaf-1蛋白留滞在Ni-NTA树脂上,然后通过westernblot检测,结果发现在斜纹夜蛾细胞凋亡的线粒体内源性通路中存在Apaf-1蛋白和CytoC之间的相互作用。之后我们构建了真核表达载体pIEl-EGFP-CytoC和pIE2-Apaf-1-Cherry,然后将它们同时转染进处于对数生长期的斜纹夜蛾细胞并在激光共聚焦显微镜下观察,结果显示转染后细胞发生凋亡并且红色代表的Apaf-1蛋白和绿色代表的CytoC蛋白存在基本的共定位现象。这些实验结果进一步肯定了在鳞翅目昆虫斜纹夜蛾中存在类似哺乳动物的内源性线粒体通路。Apaf-1多克隆抗体的制备,ORF的克隆以及与细胞色素C之间相互作用的研究都为鳞翅目昆虫细胞凋亡通路分子机制的阐明奠定了基础。
【作者】赵婧妍；
【导师】彭建新；
【作者基本信息】华中师范大学，农业昆虫与害虫防治，2014，硕士
【关键词】斜纹夜蛾；细胞凋亡；Apaf-1；免疫共沉淀；pull-down；细胞色素C；

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