油菜高亲和磷转运蛋白基因BnPht1；4的功能研究

【摘要】磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一,它既是植物体内许多重要有机化合物的组分,同时又参与植物体内多种代谢过程,如碳水化合物代谢、氮素代谢、脂肪代谢等。植物对土壤中磷素的吸收主要以无机磷(Pi)的形式。土壤对磷的强烈吸附使土壤溶液中植物可吸收的可溶性无机磷的含量非常低。研究高效吸收和利用土壤磷素营养能力的分子机制,可能为了解高等植物复杂的磷素吸收和转运提供了有价值的科学资料。而且,克隆鉴定高亲和磷转运蛋白基因,并研究揭示其功能,具有重要的生物学理论意义和潜在的农业利用价值。本研究从油菜中克隆了一个高亲和磷转运蛋白基因,命名为BnPht1;4,对该基因在植物低磷应答中的功能进行了分析,主要研究结果如下：1.BnPht1;4基因的分离鉴定和特征分析从油菜cDNA文库中克隆了一个cDNA序列,其开放阅读框(openreadingframe,ORF)为1605bp,编码532个氨基酸。序列分析预测该基因编码的蛋白与拟南芥中的高亲和磷转运蛋白AtPht1;4具有95%的相似性,因此将该基因命名为BnPht1;4.2.BnPhtl;4蛋白的亚细胞定位分析为了确定BnPht1;4蛋白的亚细胞定位,我们构建了融合表达载体BnPht1;4-GFP,利用基因枪转化洋葱表皮细胞,在共聚焦显微镜下观察发现该蛋白定位在质膜上。拓扑学分析发现,该蛋白具有12个跨膜区域,在第6和第7个跨膜区域间被分成两组。3.BnPhtl;4的组织表达分析为了研究BnPht1;4在正常条件和低磷条件下在油菜中的表达模式,我们提取了油菜根、下胚轴、子叶、茎、叶和花等不同组织的总RNA,进行RT-PCR分析。正常磷处理时,该基因在茎和花中的表达量较高；用低磷处理时,在根中的表达量显著上调,并且在处理12h后,其表达量急剧增加。4.BnPhtl;4启动子分离及活性分析从油菜基因组DNA中分离了BnPht1;4启动子,大小为1276bp。利用PlantCARE程序对该序列分析发现,它含有2个P1BS和2个W-box结合基序,GARE、TGA、TCA和ABRE等激素应答元件,及MBS和LTR非生物胁迫应答元件。将BnPht1;4启动子构建到GUS融合表达载体中进行拟南芥的遗传转化,对筛选出的阳性苗进行GUS活性分析发现,当蔗糖达到一定浓度时,用低磷处理后,在根部发现较强的GUS信号,说明该基因受低磷诱导,并且依赖于蔗糖的存在。5.过量表达BnPht1;4影响拟南芥根发育将BnPht1;4构建到过量表达载体上,导入拟南芥,获得转基因植株,进行表型分析。在正常磷处理下,过量表达BnPht1;4转基因拟南芥与野生型相比,根和地上部分都没有明显差异；经低磷(50μMPi)处理后,转基因植株的鲜重高于野生型,主根的伸长显著长于野生型；尽管转基因植株的侧根的密度少于野生型,但是侧根数目多于野生型；无机磷含量的测定也得出过量表达在地上部分和根中都高于野生型。6.低磷应答下BnPht1;4受PHR1转录因子调控分析发现BnPht1;4启动子含有两个PHR1结合元件P1BS,前期研究表明PHR1能与BnPht1;4启动子相互作用,调控BnPht1;4表达。为进一步分析这两个P1BS结合元件在BnPht1;4低磷诱导中的重要性,分别对这两个元件进行缺失突变,构建了单P1BS和双P1BS突变的重组载体BnPht1;4PM1:GUS,BnPht1;4PM2:GUS和BnPht1;4PMM:GUS,转化拟南芥。对筛选出的转基因拟南芥进行低磷处理,观察GUS活性。组织化学染色分析发现,低磷处理后,单P1BS突变(BnPht1;4PM1和BnPht1;4PM2)后BnPht1;4启动子低磷诱导活性下降。在转基因拟南芥中双P1BS突变(BnPht1;4PMM)后BnPht1;4启动子低磷诱导活性并没有完全消失,这暗示在低磷应答时,除了PHR1,可能还存在其它转录因子对BnPht1;4进行调控。7.BnPht1;4可能受WRKY75转录因子调控拟南芥中WRKY家族的转录因子WRKY75也是应答低磷的一个关键调控因子,它与PHRl在调控低磷应答基因时存在功能冗余。在BnPht1;4启动子上含有两个WRKY家族转录因子的结合元件W-box基序。通过构建载体和合成探针,用酵母单杂交和EMSA实验证明了WRKY75可以与BnPht1;4启动子相结合。实验结果显示,在低磷应答中BnPht1;4受到转录因子WRKY75的调控。
【作者】赵彩芝；
【导师】任峰；李学宝；
【作者基本信息】华中师范大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】BnPht1；4；PHR1；WRKY75；磷转运蛋白；油菜；

【参考文献】
[1]刘晶波,刘阳冰,闫秋实,韩强.基于性能的方钢管混凝土框架结构地震易损性分析[J].土木工程学报,2010,02:39-47.
[2]王艳娜.羰基不对称还原酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达优化[D].江南大学,发酵工程,2012,硕士.
[3]陈立强.荧光素钠引导手术切除脑胶质瘤的临床研究[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[4]方勇杰.美国“9·8”大停电对连锁故障防控技术的启示[J].电力系统自动化,2012,15:1-7.
[5]李长江.基于效应建模的概念设计自动化关键技术研究[D].山东大学,2008.
[6]谢明霞.基于SCADA的PMU优化配置方法的研究[D].东北石油大学,电力电子与电力传动,2013,硕士.
[7]梁晓捷.凿岩钎具国产材料替代及制造工艺的研究[D].太原科技大学,材料工程,2014,硕士.
[8]周悦生.微博侵权的法律规制[D].重庆大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[9]常郑,王欢文,胡中爱,杨玉英,张子瑜.热膨胀制备含氧官能团化的石墨烯及其电化学电容性能[J].材料导报,2012,18:49-53.
[10]刘文亮.七段式数显仪表中数字识别的研究与实现[D].大连理工大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[11]王日精.TiO_2及BiOBr改性复合物光催化降解有机污染物的研究[D].浙江理工大学,2013.
[12]邢立功,黄毅,叶罕罕,宗洪良,徐科,顾建,金勇.数字化变电站中保护装置与电子式互感器的接口方式[J].电力系统自动化,2008,16:94-97.
[13]杨广武.地下工程穿越既有地铁线路变形控制标准和技术研究[D].北京交通大学,2010.
[14]陈建能.利用454测序技术对非酒精性脂肪性肝病患者肠道菌群结构的研究[D].厦门大学,消化内科,2014,硕士.
[15]李华祥.高产孢白僵菌的发酵与茶叶病害虫防治[D].江南大学,发酵工程,2012,硕士.
[16]张大超,苏妍欣,李敏.我国城乡公共体育资源配置公平性评估指标体系研究[J].体育科学,2014,06:18-33.
[17]乐琦,张磊,王中兴.不完全序值信息下考虑主体心理行为的匹配决策[J].模糊系统与数学,2014,04:90-99.
[18]吴丹.基于网络自主学习环境下英语听力焦虑和管理策略的实证研究[D].中北大学,英语语言文学,2013,硕士.
[19]刘川巍.我国商业银行信贷定位研究[D].湖南大学,2002.
[20]王雪.中国涂鸦艺术研究[D].西南交通大学,美术学,2012,硕士.
[21]陈雪芬.Krüppel样因子4在实验性肺纤维化中的表达及干预研究[D].河北医科大学,内科学,2013,硕士.
[22]刘盼.基于CMOS的VGA接口的工业相机的设计[D].河北大学,集成电路工程,2014,硕士.
[23]苏朱刘,罗延钟,胡文宝.大地电磁测深“正演修正法”一维反演[J].石油地球物理勘探,2002,02:138-144+200.
[24]张欣欣.公司间多部门合作项目集管理研究[D].北京交通大学,2014.
[25]白晶晶.思想政治课课堂错误资源化研究[D].河北师范大学,学科教学,2012,硕士.
[26]孔令韶,李渤生,郭柯,马茂华.喀喇昆仑、昆仑山地区植物中一些元素的自然含量特征[J].植物生态学报,1995,01:13-22.
[27]王健琴.浅谈建设工程竣工验收备案[J].住宅产业.2006(07)
[28]刘裕灿.经济服务质量的伦理考察[D].山西师范大学,马克思主义理论,2014,硕士.
[29]姬翔.企业社会工作视角下的工作压力问题研究[D].西北大学,社会工作（专业学位）,2014,硕士.
[30]卢志英.包商银行个人金融业务发展战略研究[D].内蒙古大学,工商管理,2013,硕士.
[31]张殿卿.关于铁路工务养修分离体制的研究[J].中国铁路.2000(08)
[32]姜浩.隧道及地下工程丙烯酸盐喷膜防水材料耐强碱腐蚀性性能研究[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2014,硕士.
[33]邱施施.数控机床命令代码解释器的设计与实现[D].杭州电子科技大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[34]王清清.miRNA参与百草枯和MPTP致神经细胞损害及转录因子Nrf2在其中的作用初探[D].福建医科大学,劳动卫生与环境卫生学,2014,硕士.
[35]马闻声.美国法上的行政不作为司法审查研究[D].浙江工商大学,诉讼法学,2012,硕士.
[36]黄伟克.腘窝皮动脉解剖学研究[D].山东大学,外科学,2013,硕士.
[37]孙敏.内部审计对高校科研经费绩效影响的实证研究[D].北京交通大学,2014.
[38]封辉.355MPa级耐候钢中Cu、Cr和P元素的作用[D].东北大学,材料学,2010,硕士.
[39]左超.激光成像雷达距离像拼接技术[D].国防科学技术大学,信息与通信工程,2012,硕士.
[40]王欢.基于小世界隐式信任网络的自适应推荐算法[D].燕山大学,计算机系统结构,2013,硕士.
[41]王晓峰.子结构拟动力试验的组合数值积分方法研究[D].苏州科技学院,防灾减灾工程及防护工程,2012,硕士.
[42]周万嵇.活性炭负载氧化铁催化裂解蓖麻油制备癸二酸的研究[D].西北大学,能源化工,2014,硕士.
[43]刘拓.土地沙漠化防治综合效益评价——以京津风沙源治理工程河北省沽源县为例[J].绿色中国.2005(11)
[44]楼江涌.腹腔镜根治性前列腺切除术中保留膀胱颈在术后早期控尿中的作用[D].浙江大学,临床医学,2013,硕士.
[45]蔡丽.基于经济竞争性、要素互补性的甬台经济竞合问题研究[D].宁波大学,区域经济学,2012,硕士.
[46]张燕.西部地区电子信息产业发展模式研究[D].西安邮电大学,产业经济学,2013,硕士.
[47]董红启.18—19世纪初俄国农奴农村习惯法[D].吉林大学,世界史,2004,硕士.
[48]陈兴汉.宝石抛光技术的发展及影响抛光效果和速度的主要因素探讨[J].江西地质科技.1997(04)
[49]王媛媛.基于55nm工艺的E-fuse存储电路的设计与研究[D].苏州大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[50]高剑.高中语文教学设计的现状调查与对策研究[D].西北师范大学,课程与教学论,2013,硕士.