CD147单抗介导的α-常春藤皂苷壳聚糖纳米粒的制备及其肝肿瘤靶向性研究

【摘要】目的：以壳聚糖（Chitosan，CS）为载体，以水难溶性药物-常春藤皂苷（-Hederin，-Hed）为模型药物，制备-常春藤皂苷壳聚糖纳米粒（-Hed-CS-NP，HCS），再以肝肿瘤细胞表面高度表达的CD147单抗为靶头，将其偶联修饰于纳米粒表面制备CD147介导的-常春藤皂苷壳聚糖纳米粒（-Hed-CS-CD147-NP，αHCD），从而通过纳米粒的缓释效果和单抗介导的主动靶向性达到减毒增效的作用。方法：（1）以平均粒径、多分散指数（PolydisperseIndex，P.I.）和包封率（EntrapmentEfficiency，EE）为综合指标，采用乳化-溶剂扩散法制备HCS，并采用单因素试验和正交试验设计，考察纳米粒处方和制备工艺。红外（FT-IR）、X射线衍射（XRD）、差示扫描量热分析（DSC）等对αHCS纳米粒进行表征，同时系统考察纳米粒的体外释放行为及其相关药剂学性质。（2）采用EDC/NHS酰胺化反应制备αHCD，并对纳米粒进行粒径测定、FT-IR和XRD表征；采用BCA试剂盒和ELISA法分别建立CD147单抗的含量和活性测定方法；依据HepG2细胞对不同单抗修饰量纳米粒的摄取结果，选择合适的单抗修饰量。（3）以未载药的CD147单抗介导的壳聚糖纳米粒（VoidCS-CD147-NP，VCD）为对照，MTT法考察CD147单抗对肝肿瘤细胞活性的抑制作用、-Hed及其纳米粒对HepG2、SMMC-7721、HSC的细胞毒作用；采用流式细胞术检测原料药及其纳米粒对HepG2细胞的凋亡效果和对其细胞周期的影响。(4)流式细胞术方式考察HepG2在2h和24h内αHCS和αHCD的摄取率，HSC细胞作为对照细胞考察两种纳米粒的摄取差异性，并通过加入过饱和CD147进行纳米粒的竞争性抑制试验；多种细胞内吞抑制剂对两种纳米粒的摄取机制进行探讨，并考察两种纳米粒在体内的摄取分布过程。（5）分别以生理盐水组为阴性对照，环磷酰胺为阳性对照，HepG2细胞裸鼠肿瘤模型腹腔注射给予-Hed及其纳米粒后，考察其体内药效学；采用小动物活体成像技术，动态考察纳米粒在荷HepG2细胞裸鼠体内的组织分布及其肿瘤靶向性。结果：（1）乳化溶剂扩散法制备的αHCS纳米粒粒径分布均匀，平均粒径（92.7±2.77）nm，P.I.（0.134±0.036），包封率（75.63±4.06）%；透射电镜观察纳米粒外观形态圆整；FT-IR、XRD、DSC表征结果表明药物已分散于壳聚糖纳米粒中；体外释放显示壳聚糖纳米粒具有一定的缓释特性。（2）CD147能通过酰胺反应偶联修饰到αHCS表面；与αHCS的粒径相比，αHCD的粒径变化较小；偶联所得αHCS中CD147单抗饱和修饰量为（6.55±0.234）μg/mgNP，结合不同修饰量对纳米粒摄取结果影响、单抗的活性和过多修饰量可能产生的空间位阻效应等因素，本实验最终确定修饰量为1.5μg/mgNP，且单抗活性保留率为（57.07±0.60）%。（3）MTT实验结果表明未载药单抗修饰的壳聚糖纳米粒VCD及本实验所用CD147单抗修饰量均对肝肿瘤细胞无细胞毒作用，原料药及其纳米粒对HepG2、SMMC-7721的IC50值为αHCD<HCS<-Hed，以HSC细胞为对照，提示与单抗介导的主动靶向性有关；通过细胞凋亡实验结果与HepG2细胞MTT实验相一致；在细胞周期实验中发现细胞在S期的百分比有所增加。（4）HepG2细胞对纳米粒摄取具有时间依赖性，且αHCD的摄取明显高于HCS，另外HSC对两种纳米粒摄取无差异，结合过饱和竞争抑制实验中αHCD摄取率明显下降，说明αHCD纳米粒对肝肿瘤细胞具有更好的亲和性；从摄取抑制剂实验结果可发现载药纳米粒的内吞摄取过程属于能量依赖型，需通过形成有被小窝内陷和网格蛋白介导的内吞进入细胞，且与细胞膜结构稳定性和流动性息息相关。倒置荧光显微镜结果显示纳米粒1h时大多聚集在细胞膜表面，3h时细胞摄入纳米粒明显增多。（5）体内药效学实验中，HCS（79.02%）和αHCD（88.43%）纳米粒的抑瘤率远高于原料药中剂量组（53.83%）；纳米粒组抑瘤率均在70%以上，且存在剂量依赖性。近红外荧光成像实验结果发现，尾静脉给药1h后，两种纳米粒在肿瘤部位和肝脏可见较为集中的荧光分布，在6h时，肿瘤部位荧光强度有所减弱，12h后纳米粒荧光开始减弱。结论：乳化溶剂扩散法制备的αHCS大小分布均匀、外观形态圆整、包封率高，有缓释特性，体外体内药效学实验表明空白纳米粒与细胞具有生物相容性，αHCD对肝肿瘤细胞的毒副作用的增强和肝肿瘤细胞对该纳米粒摄取的增多与CD147单抗介导的主动靶向性有关。综上所述，αHCD具有应用潜能并有望成为一种新型的难溶性药物的载体。
【作者】朱蓉；
【导师】张学农；
【作者基本信息】苏州大学，药剂学，2014，硕士
【关键词】CD147单抗；α-常春藤皂苷；壳聚糖纳米粒；肝肿瘤；体内外靶向；

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