产1,3-丙二醇基因工程菌的构建

产1,3-丙二醇基因工程菌的构建

作者:师大云端图书馆 时间:2016-04-08 分类:期刊论文 喜欢:3558
师大云端图书馆

【摘要】1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,在聚酯合成领域有很好的应用前景,其生物生产方法已经引起了广泛的重视。在主要的1,3-PD生产菌之一——克雷伯肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)中,甘油通过两个酶转化成1,3-PD,分别是甘油脱水酶(GDHt)和1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)。本实验克隆了K.pneumoniae中编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因dhaT,在大肠杆菌中进行了表达研究。采用胞内表达方式,1,3-丙二醇氧化还原酶以很好的可溶性蛋白存在,酶活达到96.8U/ml。经亲和层析纯化后,研究了重组1,3-丙二醇氧化还原酶的pH稳定性及温度稳定性,重组酶的最适pH为9.5,最适温度为30℃。克隆了K.pneumoniae中编码甘油脱水酶的dhaB基因,构建了三种不同的表达质粒,在大肠杆菌中进行了表达研究。SDS-PAGE和酶活分析结果表明,直接表达整个阅读框架时,只有α亚基得到表达;串连表达时,在基因之间引入人为设计的RBS序列,能够有效的表达甘油脱水酶的三个亚基;融合表达则是去掉了dhaB1及dhaB2的终止密码,在两两亚基之间各引入了10个简单氨基酸残基。串连表达方式的酶活最高,经进分离纯化后酶活达90U/mg。克隆了甘油脱水酶再激活因子的基因(gdrAB)并在大肠杆菌中实现了表达,作为甘油脱水酶的分子伴侣,再激活因子能够有效的激活失活的甘油脱水酶,使得甘油脱水酶在催化甘油转化为3-羟基丙醛时的活力大大提高。利用含有不相容质粒的重组大肠杆菌系统,双质粒共同表达1,3-丙二醇代谢途径中的关键酶基因dhaB和dhaT,以及甘油脱水酶再激活因子基因gdrAB,在有选择压力存在的条件下,重组菌可以保持较好的质粒稳定性,同时可以有效的表达目的蛋白。另外尝试了使用1,3-丙二醇氧化还原酶的同功酶——醇氧化还原酶编码基因yqhD替代dhaT,构建的两株重组菌的1,3-丙二醇产量分别达到8.6g/l和13.2g/l。为了提高K.pneumoniae的生产强度及效率,本实验构建了表达质粒pKP-28a-dhaBY,并在K.pneumoniae体内进行表达,利用重组菌生产1,3-丙二醇,无论在厌氧还是微氧条件下,重组菌1,3-丙二醇代谢途径关键酶的酶活显著提高。对构建的重组克雷伯肺炎杆菌进行了微氧发酵,转化率比厌氧时稍微降低,但1,3-丙二醇浓度和生产强度有所提高。在微氧条件下以葡萄糖为辅助碳源进行发酵,初始添加8g/l葡萄糖可以将生产强度提高30%以上;以甘油:葡萄糖=8:1的比例补料可以将甘油转化率提高16%;发酵初始和补料均添加葡萄糖时,重组菌的1,3-丙二醇浓度、甘油转化率和生产强度比野生克雷伯菌依次提高了19.2%、8.3%和19.2%。采用重组克雷伯肺炎杆菌结合微氧和加糖的补料批式发酵,1,3-丙二醇浓度(69.5g/l)、甘油转化率(0.65mol/mol)和生产强度(2.32g/lh)比最初的野生型厌氧发酵的1,3-丙二醇浓度(55.6g/l)、甘油转化率(0.54mol/mol)和生产强度(1.25glh)依次提高了25%、20.4%和85.6%,而且发酵过程中乳酸含量极低。为了提高重组K.pneumoniae的产物耐受力从而提高产量,本研究使用紫外线一氯化锂复合诱变联合菌种驯化的方法,对构建的重组Kpneumoniae进行了诱变与筛选工作,获得了可耐受较高1,3-丙二醇浓度的优良突变菌株M-5。与诱变驯化前相比,1,3-丙二醇产量提高了24%,乙酸产量也有相应的提高,而乙醇产量有所降低。与最初的野生克雷伯肺炎杆菌厌氧发酵相比,1,3-丙二醇产量提高了56.1%,生产强度提高了131.5%。经过30L发酵罐放大,产量基本维持在87g/l。通过同源重组的手段敲除了Kpneumoniae的乙醛脱氢酶基因。摇瓶筛选得到了三株突变菌株,将乙醇产量最低的6号突变株应用于发酵中,发酵进行到12h~16h,菌体停止生长,代谢也基本停止,不再产生1,3-丙二醇,和亲株同期相比,生物量少了3个OD,乙醇浓度减少了37%,乙酸浓度比亲株同期增大了一倍,菌体生长受到明显影响。通过驯化提高菌体对乙酸的耐受力有望改变这种不利状况。
【作者】王凤寰;
【导师】谭天伟;
【作者基本信息】北京化工大学,生物化工,2007,博士
【关键词】1,3-丙二醇;克雷伯肺炎杆菌(K.pneumoniae);1,3-丙二醇氧化还原酶;甘油脱水酶;再激活因子;重组菌;驯化;发酵;

【参考文献】
[1]聂建国.工商银行湖南省分行社会责任管理机制研究[D].湖南大学,高级管理人员工商管理(EMBA),2013,硕士.
[2]高小伶.当前社会管理的创新研究[D].浙江理工大学,马克思主义基本原理,2014,硕士.
[3]李宇.基于网络基础的信息交流的技术机制[J].图书馆建设,2002,03:75-79.
[4]刘江春.带钢表面缺陷智能化辨识方法的研究[D].西安理工大学,测试计量技术及仪器,2004,硕士.
[5]王晨.和县人才资源开发研究[D].安徽大学,行政管理,2014,硕士.
[6]赵旭朋.浅析公共场所管理者的安全保障义务[D].西南政法大学,法律(专业学位),2012,硕士.
[7]朱豪科.片基带数控分切机的设计及研究[D].浙江工业大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[8]闻晶.基于PLC的弹簧整定机控制系统的设计[D].西南交通大学,机械电子工程,2013,硕士.
[9]胥艺.城市道路交通拥挤收费公众意愿调查研究[D].西南交通大学,交通运输规划与管理,2013,硕士.
[10]李潇华.中国货币供给高速增长的原因及影响分析[D].山东财经大学,政治经济学,2013,硕士.
[11]王珺琦.长春高新区产业集群发展研究[D].吉林大学,马克思主义发展史,2014,硕士.
[12]王卫东.未来的数字医院系统及其关键技术[J].医疗设备信息,2004,07:1-4.
[13]欧阳萍.论孔多塞的启蒙思想[D].湘潭大学,专门史,2003,硕士.
[14]于海玲.稀土氧化物纳米线的制备及其性能研究[D].安徽大学,应用化学,2013,硕士.
[15]王琳.网络环境下情报学的应用模式研究[D].天津师范大学,2004.
[16]吴刚.数字X光胸片肺部分割的研究[D].中国科学院深圳先进技术研究院,模式识别与智能系统,2014,硕士.
[17]张安安,方玮,刘凡,沈霞,陈贵.基于超体积因子搜索技术的电压/无功协调控制[J].电力系统自动化,2013,10:65-71.
[18]桂亚云.时钟操纵在时间系统形式验证中的应用[D].上海大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[19]高润纲.金属银修饰石墨烯纸的制备及性能研究[D].上海交通大学,2013.
[20]李庆胜.锚杆钻机液压系统可靠性研究[D].燕山大学,流体传动及控制,2014,硕士.
[21]徐立彬.乒乓球运动员对发球旋转知觉判断的认知神经机制研究[D].上海体育学院,运动人体科学,2014,博士.
[22]谢峰.蝴蝶兰的组织培养研究[D].广西大学,作物栽培学与耕作学,2004,硕士.
[23]曹鹏.公共危机管理中我国政府与非政府组织互动机制研究[D].南京师范大学,行政管理,2012,硕士.
[24]吴增荣.基于DSP的高频实时信道模拟[D].大连海事大学,通信与信息系统,2004,硕士.
[25]李婧.钢琴教学中的音乐表现力研究[D].河北师范大学,音乐学,2012,硕士.
[26]陈海燕.组织变革中的员工关系管理研究[D].首都经济贸易大学,工商管理(专业学位),2013,硕士.
[27]宋伟国.小麦生长可视化关键技术研究[D].南京农业大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[28]栗占宝.数据融合技术在动力定位控制系统中的应用研究[D].大连海事大学,轮机工程,2013,硕士.
[29]侯军梅.OsCYP2超量表达突变体响应盐胁迫相关蛋白质组学分析[D].吉林农业大学,作物遗传育种,2012,硕士.
[30]樊晨,刘中柱,蔡开科,刘石虹,梁玫,巩飞,刘瑞宁.BOF—LF—CC工艺生产45号钢钢水洁净度的研究[J].钢铁.2003(03)
[31]刘芳.学术自由的有限性分析[D].湖南工业大学,伦理学,2012,硕士.
[32]徐文辉.M公司拖拉机发展战略研究[D].南昌大学,工商管理(专业学位),2012,硕士.
[33]王飞.复杂背景下条形码检测[D].西安电子科技大学,控制理论与控制工程,2012,硕士.
[34]刘明亮.论我国非正规金融组织的法律规制[D].吉林财经大学,法律(专业学位),2014,硕士.
[35]张琪.氧化锌基光催化材料的设计合成及性能研究[D].黑龙江大学,材料物理与化学,2013,硕士.
[36]任建斌.基于小波变换和BP人工神经网络的遥感影像分类研究[D].内蒙古师范大学,地图学与地理信息系统,2012,硕士.
[37]王莉丽.羟基磷灰石/氧化锆生物复合材料制备与性能研究[D].陕西科技大学,材料学,2014,博士.
[38]高超.烟台市城市社区体育现状调查与对策研究[D].鲁东大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[39]姜礼节,吕征宇.基于混合开关的三相双重整流桥电流型脉宽调制整流器[J].电力系统自动化,2011,08:67-71.
[40]谢忱.应用伦理学视阈的身体伦理探究[D].西南大学,伦理学,2013,硕士.
[41]陈磊.基于排队网的FFS设备配置近似优化方法研究[D].广东工业大学,机械电子工程,2013,硕士.
[42]薛荣秋.土工格栅加筋土挡墙抗震特性与残余变形研究[D].江苏科技大学,结构工程,2014,硕士.
[43]彭晓莉.我国交强险赔偿制度研究[D].山东财经大学,民商法学,2012,硕士.
[44]陈梦丽.“东风日产”企业文化重塑的跨文化研究[D].武汉理工大学,传播学,2012,硕士.
[45]刘雨迪.红壤地区农田土壤线虫群落对耕作年限和施肥措施的响应及指示价值分析[D].南京农业大学,生态学,2013,硕士.
[46]倪莉.信息组织研究述评[J].情报资料工作,2001,02:16-18.
[47]陆爱珍.吸入一氧化氮诱导内皮祖细胞归巢防治支气管肺发育不良的研究[D].复旦大学,儿科学,2013,博士.
[48]于彦彦.震源参数对近断层PGV分布的影响研究[D].苏州科技学院,防灾减灾工程及防护工程,2012,硕士.
[49]许飞燕.多平台船载雷达系统的数据处理技术研究[D].哈尔滨工业大学,信息与通信工程,2013,硕士.
[50]王月芳.博物馆文化商品开发与营销研究[D].中国艺术研究院,艺术学,2012,硕士.

相关推荐
更多