新型人源化抗CD20单克隆抗体的表达和活性检测

【摘要】B细胞淋巴瘤是发生在B细胞的实体肿瘤,主要可以分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’slymphoma,NHL).NHL在血液系统恶性肿瘤中十分常见,对人类生命健康造成极其严重的威胁。但到目前为止,临床上传统的化疗药物对NHL的治疗效果并不理想,科学家正在研发各种新型药物来治疗NHL。单克隆抗体因为其高特异性和靶向性而发展迅速。B淋巴细胞抗原CD20是人类B淋巴细胞表面上所特有的标识,主要由297个氨基酸构成。根据不同的磷酸化水平,CD20的分子量为33-37kD,属于非糖基化磷蛋白。CD20分子是一种有四个跨膜区的跨膜蛋白,它的N端和C端都位于细胞质内侧。CD20分子的主要抗原表位位于第三、四跨膜区之间,是一个由43个氨基酸组成的环状区域。从前体B细胞到后来的分化过程,CD20广泛表达于B细胞的表面,但是不表达于晚期分化的浆细胞中。CD20表达于B细胞发展的除了最初和最后以外的所有阶段。CD20在B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病和黑色素瘤肿瘤干细胞中均被发现。CD20分子位于B细胞膜表面,抗体接近的空间位阻较小,因此CD20分子成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点。虽然CD20的功能尚未完全清楚,但是它在Ca2+跨膜传递,维持细胞内Ca2+聚集和B细胞激活方面发挥着重要作用。Rituximab是一种与B细胞表面CD20分子特异性结合的人/鼠嵌合型单克隆抗体。Rituximab是一种糖基化IgGlK免疫球蛋白,其中鼠源来自于鼠抗CD20单抗的可变区Fab段,人源来自于人IgGl抗体稳定区Fc段。Rituximab由1328个氨基酸组成,分子量约为144Kd。Rituximab由IDEC公司研发,药品名称是IDEC-C2B8。因为Rituximab具有杀伤B细胞的功能因此被用于治疗以B细胞过量表达,B细胞过度活化或B细胞功能失调为特点的相关疾病,例如：白血病、淋巴瘤、移植排斥反应和自身免疫性疾病。基于其临床试验中显示的安全性和有效性,美国食品和药物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)在1997年批准Rituximab用于治疗对于其他化疗方案无效的B细胞非霍奇金淋巴瘤。2010年欧盟委员会批准Rituximab用于滤泡性淋巴瘤初始治疗后的维持治疗。在三组随机对照试验中,Rituximab已经被证明是一种有效治疗类风湿性关节炎的药物,现在已经批准用于难治愈型类风湿性疾病的治疗。美国FDA批准Rituximab与甲氨蝶呤(MTX)联合用于治疗对抗TNFa治疗反应不足的中度至严重活动性成人类风湿关节炎。在欧洲,Rituximab仅被批准与甲氨蝶呤联合治疗抗TNFa治疗反应不足的严重活动性类风湿关节炎。其他Rituximab治疗的自身免疫性疾病包括：自身免疫性溶血性贫血、纯红细胞再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、埃文斯综合症、血管炎、大疱的皮肤疾病、Ⅰ型糖尿病、干燥综合征、德维克病和Graves眼病等。Rituximab是一种人鼠嵌合型的抗CD20单克隆抗体,具有30%左右的鼠源蛋白,因此长期使用会引起免疫原性。因此,寻求更为有效的抗CD20抗体用于B淋巴瘤的治疗显得尤为迫切。我们通过计算机模建技术,在蛋白质结构数据库中找到与Rituximab空间结构最相近的人IgG1为骨架,将Rituximab的CDR区进行移植和改造,通过重叠PCR方法,扩增出目的基因片段。分别将轻、重链基因片段克隆到载体pcDNA3.3.Poptivec质粒上。瞬时转染至293F细胞,收取细胞上清,用rProteinA亲和层析法纯化目的抗体,并用SDS-PAGE检验抗体的表达量,采用Fortebio技术检测抗体与抗原的结合能力,最后进行裸鼠移植瘤生长抑制实验以检验抗体的抗肿瘤活性。结果显示：抗体的轻、重链质粒已经被成功构建,并且顺利的转染和表达,最终纯化得到13种目的抗CD20人源化抗体。抗体在还原SDS-PAGE中表现为相对分子质量约为25Kd和55Kd两条带,与预计条带大小相符；Fortebio实验结果表明,13组抗体与抗原具有良好的亲和活性,其中：L4H7抗体的Kd值为1.91×10-9mol/L、L5H5抗体的Kd值为7.35×10-10mol/L、L5H7抗体的Kd值为1.91×10-9mol/L。裸鼠移植瘤生长抑制实验表明,L5H7抗体的抗肿瘤活性优于Rituximab。下一步,我们将增加实验动物的数量,进一步验证抗体L5H7的抗肿瘤活性和安全性,以期获得亲和力更强,抗肿瘤活性更高并且副作用更少的安全有效的人源化抗CD20单克隆抗体,为临床上NHL的有效治疗提供了新的手段。
【作者】贾茹；
【导师】曹诚；
【作者基本信息】安徽大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】CD20；人源化；单克隆抗体；

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