碳酸钙微球作为p53基因载体的研究

【摘要】肿瘤发生多数与基因突变有关，因此，通过基因治疗手段改造或纠正突变基因对于癌症治疗具有重要意义。基因载体的安全性和有效性是实现基因治疗的关键因素之一。研究高效、安全的基因载体是当前研究的焦点。本论文采用化学沉淀法制备出三种不同性质的碳酸钙微球，并将碳酸钙（CaCO3）微球作为基因载体，用聚乙烯亚胺（PEI）表面修饰，探究经PEI修饰的碳酸钙微球作为基因传递载体的可能性及其携载重组质粒pEGFP-C1-p53的体内外抑癌效果。方法：（1）制备三种不同性质的球形CaCO3颗粒，通过场发射扫描电镜（SE-FEM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶红外光谱（FTIR）以及动态光散射（DLS）等方法对合成的CaCO3颗粒形貌、粒径和结晶度等性质进行表征，建立稳定合成碳酸钙微球的工艺路线。（2）采用聚乙烯亚胺PEI对纳米结构的CaCO3微球表面修饰。研究表面修饰后的碳酸钙微球携载p53基因转染多种癌细胞和正常细胞（Hep3B、H1299、Hela、QSG-7701和293a）的效果。通过荧光显微镜观察GFP-P53融合蛋白的表达。（3）通过MTT实验研究碳酸钙微球的生物安全性及CaCO3-PEI-pDNA复合物的抑癌效果；Hoechst33342染色研究复合物的抑癌机理。（4）构建裸鼠Hep3B肝癌移植瘤模型，瘤内注射碳酸钙载体-基因复合物，探究修饰后的碳酸钙微球的体内抑癌效果，并通过肿瘤组织切片HE染色和TUNEL染色等病理学结果分析抑癌机制。结果：（1）通过添加不同的调控剂，制备出三种不同形貌、晶型及粒径大小的CaCO3微球，平均粒径分别为：960nm、976nm和510nm。三种颗粒形貌均为球形，分散性良好，粒径分布较均一且表面粗糙度较大。（2）通过研究在不同pH值条件下碳酸钙微球的降解情况，实验结果显示碳酸钙微球在酸性pH下能够更快速地降解，且与其它两种微球颗粒相比，SCa微球的酸性pH依赖性更大。说明碳酸钙微球能够响应酸性pH值，具有pH依赖性。通过研究不同浓度下碳酸钙微球的生物相容性情况，结果发现在一定浓度范围内三种碳酸钙微球的毒性较低，表明这三种碳酸钙微球都具有良好的生物相容性，且ACa的生物相容特性最佳。（3）体外细胞实验证实经表面修饰的CaCO3微球作为基因载体携载p53基因能够将基因传递至细胞内并成功表达融合蛋白GFP-P53，有效地抑制癌细胞增殖。（4）体内动物实验结果显示SCa-PEI-pEGFP-C1-p53能有效地抑制肿瘤生长。
【作者】韩华锋；
【导师】孔祥东；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】基因治疗；碳酸钙微球；表面修饰；p53基因；抑癌效果；

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