BmNPV DNA结合蛋白GP88对病毒复制和转录调控机制的研究

BmNPV DNA结合蛋白GP88对病毒复制和转录调控机制的研究

作者:师大云端图书馆 时间:2021-10-30 分类:硕士论文 喜欢:2048
师大云端图书馆

【摘要】众所周知,通过基因敲除的方法研究杆状病毒基因的功能是一种很有效的手段,特别是探究基因在病毒感染周期中对病毒复制和基因转录调控的影响方面尤为突出。GP88蛋白是家蚕杆状病毒(BmNPV)基因组中的一种DNA结合蛋白,被认为是一种病毒基因转录调控因子,然而,在病毒DNA复制、转录过程中GP88蛋白是否起着某种调节作用还未可知。在这项工作中,我们运用Red重组技术敲除了BmNPV的gp88基因,构建了gp88缺失型病毒gp88-ko-Bacmid;再利用Bac-to-Bac技术构建了gp88补回型病毒gp88-re-Bacmid,再将三种病毒Bacmid(wtBacmid、gp88-ko-Bacmid和gp88-re-Bacmid)DNA转染BmN细胞,经过实验分析发现,gp88缺失型病毒TCID50为零,而gp88修复型病毒的TCID50则与野生型基本相同(p>0.05),这说明gp88基因缺失会导致不能形成具有感染活性的病毒粒子。为了深入了解GP88的生物学功能,我们利用荧光定量PCR技术分析了三种病毒Bacmid转染细胞后病毒基因组DNA的复制情况以及病毒早期、晚期和极晚期基因的转录情况。结果显示,缺失gp88基因后,病毒基因组DNA的复制水平较野生型和补回型病毒均显著降低(p<0.05);病毒早期基因lef-3、ie-1和dnapol,晚期基因vp39与极晚期基因p10的转录水平相比较修复型与野生型病毒而言均有显著降低(p<0.05)。WesternBlot检测显示gp88基因的缺失会导致LEF3、VP39以及P10基本不表达,而野生型和gp88补回型病毒则检测到上述三种蛋白表达。透射电镜检测结果也进一步证实了gp88基因缺失后,细胞内无成熟的病毒粒子形成,而gp88基因修复后,电镜观察的情况与野生型病毒相似,有大量成熟的病毒粒子产生。综上研究结果表明:gp88基因的缺失会导致BmNPV基因组复制水平显著降低;敲除gp88后会导致BmNPV各时期基因的转录水平显著下降,同时也会导致病毒早期、晚期和极晚期蛋白表达水平显著降低或不表达,并且不能形成具有感染性的病毒粒子。
【作者】张臣;
【导师】于威;
【作者基本信息】浙江理工大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士
【关键词】BmNPV;gp88基因;Red重组系统;BactoBac系统;基因敲除;基因补回;

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