EvaGreen多重实时荧光定量PCR同时检测多种猪病毒研究

【摘要】猪细小病毒（Porcineparvovirus，PPV）、猪圆环病毒Ⅱ型（Porcinecircovirus2，PCV2）、猪繁殖与呼吸综合症（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）、猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）、日本脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）、伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）这几种病毒引起的疾病在临床上常呈现出相似的呼吸和繁殖障碍症状，并且常常呈混合感染，给养猪业造成重大损失。依据常规病原学检测及临床病理变化很难作出准确的判断，尤其是多种病原混合感染时，难以进行早期快速检测，容易产生误判错判，因此建立一种快速准确能同时对多种病原进行检测的方法对疾病的诊断和防治具有重要意义，而兼有多重PCR和实时荧光PCR优点的多重实时荧光PCR方法可以应用于多病原混合感染的快速检测。多重实时荧光PCR包括荧光探针和荧光染料两类。探针多重实时荧光PCR的特异性较好，但由于受到实时荧光PCR仪器检测通道限制，无法同时进行四种以上的病原检测，而且设计多条探针会增加总成本。荧光染料多重实时荧光PCR是通过识别扩增产物熔解峰以达到检测目的，不受检测通道限制。荧光染料EvaGreen相比SYBRGreenⅠ具有更高敏感性和稳定性，而且在多重检测中克服了对扩增子的结合偏爱性，因此EvaGreen更适合于多重实时荧光PCR，基于本研究建立的EvaGreen多重实时荧光PCR方法，能够快速有效的同时检测六种猪病毒，并具有简便易行、成本较低等优点。基于最终需要建立EvaGreen多重实时荧光PCR方法，本研究首先建立了六种猪病毒EvaGreen单重实时荧光PCR检测方法，其中六种病毒经实时荧光PCR扩增后产生的熔解峰能够有效区分，是各病毒单重实时荧光PCR优化的前提条件，通过选定的引物同时对目的核酸序列和非目的核酸序列扩增来检测特异性，结果显示PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、JEV和PRV均无非特异性扩增；并进行六种病毒的灵敏度检测，其中PCV2和CSFV的检测极限可达10copies/μl，PRV和JEV的检测极限可达25copies/μl，PPV和PRRSV的检测极限可达50copies/μl；分别选取各病毒的3个浓度进行批内和批间重复试验，变异系数均在5%以内，显示各病毒单重实时荧光PCR重复性良好。在六种猪病毒EvaGreen单重实时荧光PCR优化完成的基础上，建立一个EvaGreen多重实时荧光PCR体系，经实时扩增能够产生六个目的扩增产物的熔解峰，其中PCV2扩增产物的熔解峰相应的熔解温度（Tm）为77.7±0.29°C，PPV为79.5±0.36°C，PRRSV为82.2±0.30°C，CSFV为85.3±0.35°C，JEV为87.3±0.31°C及PRV为91.3±0.25°C，从而可同时对这六种病毒进行检测。通过分别加入靶基因和非靶基因进行扩增，以检测特异性，结果显示六种猪病毒在EvaGreen多重实时荧光PCR中均无非特异性扩增；并进行了灵敏度检测，灵敏度结果显示：PCV2、PRRSV和JEV的检测极限达到100copies/μl；PPV、CSFV检测极限可以达到250copies/μl；PRV的检测极限可以达到500copies/μl；同时进行了批内和批间重复试验，结果显示批内和批间重复的Tm变异系数均在5%以内。由于多病原混合感染也常出现在实际检测中，故选取几种较易发生混合感染的病毒组合进行灵敏度检测，其中在CSFV浓度为106copies/μl时，PCV2灵敏度可达250copies/μl；PCV2浓度为105copies/μl时，PRRSV灵敏度可达250copies/μl；PPV浓度为106copies/μl时，PCV2灵敏度可达500copies/μl；PCV2、PPV浓度分别为105copies/μl和106copies/μl时，PRRSV的最低检测极限为500copies/μl。本研究表明，六种猪病毒的多重EvaGreen实时荧光PCR方法具有较好的特异性、灵敏度、重复性。应用建立的EvaGreen多重荧光PCR方法对58份血清和60份组织样品分别进行了检测。58份血清样品中，PCV2的阳性率为19.0%，PRRSV的阳性率为24.1%，PCV2与PRRSV混合感染占总样品数10.3%；在对60份组织样品检测中，PCV2、PPV、PRRSV和PRV检出率分别为23.3%、15%、16.7%及5%，PCV2与PRRSV、PCV2与PPV及PCV2、PPV与PRRSV混合感染检出率分别为6.7%、5%及5%，而应用普通PCR检测组织样品，PCV2检出率仅为21.6%。通过比较分析，EvaGreen多重实时荧光PCR较普通PCR具有更高的灵敏度，并可最大限度节约检测时间。总之本研究成功建立了六种猪病毒EvaGreen多重实时荧光PCR方法，可以对这六种猪病毒进行快速准确地检测和鉴定。
【作者】饶品彬；
【导师】姜永厚；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】猪病毒；EvaGreen；多重荧光PCR；熔解曲线；检测；

【参考文献】
[1]海莲.蒙古黄榆体细胞胚胎发生的调控因子及多胺的研究[D].内蒙古农业大学,林业,2013,硕士.
[2]曾庆贺.主要农作物品种审定法律问题研究[D].华中农业大学,经济法学,2014,硕士.
[3]黄莹仪.EPA、DHA对力竭运动小鼠骨骼肌细胞膜流动性影响的实验研究[D].辽宁师范大学,运动人体科学,2012,硕士.
[4]孙晓曦.小学“校医”问题与对策研究[D].黑龙江大学,教育管理,2013,硕士.
[5]郝二成.市政管道污水直接回用技术研究[D].北京工业大学,市政工程,2004,硕士.
[6]裴文亭.藏红花素对正常儿童外周血淋巴细胞DNA损伤及修复的影响[D].青岛大学,儿科学,2013,硕士.
[7]唐全.受氯代苯酚污染水体沉积物厌氧生物修复的应用基础研究[D].浙江大学,环境工程,2004,硕士.
[8]李林.国际贸易中技术壁垒的法律问题[D].苏州大学,法律,2003,硕士.
[9]王俊延.荀子荣辱思想研究[D].河北经贸大学,伦理学,2012,硕士.
[10]杨晓菲.江苏省游泳裁判员队伍的现状调查与发展对策研究[D].中国矿业大学,体育教育训练学,2014,硕士.
[11]王琳.好莱坞科幻电影中的女性形象研究[D].重庆大学,戏剧与影视学,2014,硕士.
[12]张自驰,张国钢,耿英三,王建华,张溪.磁传感器阵列测量大电流实验系统[J].电力系统自动化,2007,18:77-81.
[13]潘程浩.周视激光探测系统信号处理研究[D].北京理工大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[14]房庆恒.路侧解体消能标志设计指标与方法研究[D].哈尔滨工业大学,交通运输工程,2014,硕士.
[15]张彦峰.一种高带宽低噪声的ΣΔ小数频率合成器[D].国防科学技术大学,软件工程,2013,硕士.
[16]章铭.太湖五里湖生态修复示范区水质改善效果分析[D].华中农业大学,湿地资源与环境,2012,硕士.
[17]张亚峰.慢性萎缩性胃炎伴胆汁反流中医证型的分布特点及胃肠激素的相关性研究[D].福建中医药大学,中西医结合临床（专业学位）,2014,硕士.
[18]陈铭义.交流电机电气调速节电技术[J].北京节能.1991(01)
[19]杨绍国,周熙襄.多波多层AVO数据反演[J].石油地球物理勘探,1994,06:695-705+800.
[20]刘自伟,蔡勇,陈波.KDD在入侵检测中的应用探讨[J].兵工自动化,2003,05:21-24.
[21]涂莎.“两会”政务微博研究[D].湖北工业大学,计算机技术（专业学位）,2013,硕士.
[22]王红芳.不分明化拓扑空间中一些拓扑性质的研究[D].内蒙古师范大学,基础数学,2012,硕士.
[23]张云飞.高速公路交通安全分析及评价研究[D].长安大学,交通信息工程及控制,2013,硕士.
[24]李娜.基于WEB的通用办公自动化系统[D].吉林大学,软件工程,2012,硕士.
[25]李伟岸.兔滑膜间充质干细胞体外多向分化潜能的实验研究[D].广西医科大学,创伤骨科手外科,2013,硕士.
[26]霍莉.一维自组装有序NiO_x掺杂TiO_2纳米管的制备及光电性质研究[D].哈尔滨工业大学,化学工程与技术,2013,硕士.
[27]高树艳.试题权重未知条件下能力的加权估计方法[D].东北师范大学,应用数学,2012,硕士.
[28]吴伟,唐光宇,卢浩.铁路地理信息系统开发设想[J].中国铁路.2001(12)
[29]邹阿琴.论德国承租人终止保护制度及其对中国的借鉴意义[D].中国政法大学,比较法学,2014,硕士.
[30]黄瑀.教育培训机构客户关系管理系统的设计与实现[D].厦门大学,软件工程,2014,硕士.
[31]何嗣江,史晋川.弱势群体帮扶中的金融创新研究——以台州市商业银行小额贷款为例[J].浙江大学学报(人文社会科学版)预印本,2009,01:1-9.
[32]孔德新.B-Raf~(V600E)选择性抑制剂的设计、合成及生物活性研究[D].吉林大学,药物化学,2014,硕士.
[33]张晓燕.顾贞立及其词研究[D].西北师范大学,中国古代文学,2013,硕士.
[34]刘威宏.基于行政法角度的城市管理综合执法实践的理论及其对策研究[D].天津大学,公共管理,2013,硕士.
[35]林伟林,林有.数据挖掘在上市公司财务状况分析中的应用[J].市场周刊.财经论坛,2004,10:98-99.
[36]杨硕.房地产开发全过程项目管理研究[D].华中师范大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[37]张敏.卒中患者急性期的抑郁筛查及与卒中后抑郁相关因素的研究[D].华中科技大学,神经病学,2013,硕士.
[38]费峥峥.分子伴侣协助的基因工程药物重组人干扰素-γ体外重折叠研究[D].浙江大学,生物化学工程,2004,硕士.
[39]彭志雄.东升教育集团薪酬体系改进方案设计[D].兰州大学,工商管理,2012,硕士.
[40]吴晓丰.哮喘缓解期患儿MP、Ig、IL-4、IFN及肺功能与中医证型的关系[D].湖北中医学院,中西医结合儿科,2004,硕士.
[41]郑治华.膜上高速移栽机构试验研究[D].河南科技大学,农业机械化工程,2014,硕士.
[42]戴小雨.小说《了不起的盖茨比》人物对白的语用分析[D].江苏科技大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[43]陈乐乐.基于声传感器网络的目标定位方法研究与系统实现[D].江苏科技大学,电子与通信工程（专业学位）,2014,硕士.
[44]张红振.“分层与协作”教学模式在投掷技术教学中的实验研究[D].北京体育大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[45]徐越.面向高性能计算的分布式内存文件缓存系统[D].华中科技大学,计算机技术,2013,硕士.
[46]王婷.纪检电子监察系统分析与设计[D].厦门大学,软件工程,2014,硕士.
[47]燕样样,李红莉,姚永红.45钢滚轮淬火开裂原因分析[J].热加工工艺,2014,20:211-212+217.
[48]韦晓淋.血管紧张素Ⅱ与高血压及其代谢性危险因素的关系[D].苏州大学,公共卫生（专业学位）,2013,硕士.
[49]刘少林,刘有山,汪文帅,李小凡,张美根.最优化广义离散Shannon奇异核褶积微分算子地震波场模拟[J].石油地球物理勘探,2013,03:410-416+506+328-329.
[50]卡琦.圣彼得堡旅游业开发研究[D].华中师范大学,旅游管理,2013,硕士.