深海弯曲菌（Thalassolituus spp.）低温烷烃降解机制的研究及其在海洋环境中多样性分析

【摘要】海洋石油污染问题广受关注,烷烃是原油中的重要成分。在南北极和其他低温地区人类活动的增加,研究低温地区的石油烃降解具有重要意义。前期研究表明,深海弯曲菌(Thalassolituus)在北冰洋表层海水的石油富集菌群中常常以绝对优势菌出现在石油降解菌群,但是原因不明。为此,本文以已经获得深海弯曲菌菌株R6-15为出发菌,以食烷菌(Alcanivorax)模式菌株A.borkumensisSK2、A.dieseloleiB-5和A.jadensisT9为参比菌株,研究它们烷烃低温降解的优势机制。为进一步验证实验结果,本文又重新从北极低温富集菌群中分离获得了另外一株降解菌Thalassolituussp.4BN06-13与R6-15平行开展比较分析。本文以正十四烷为代表性烷烃底物,对比分析了它们在低温(15℃)和常温(25℃)下降解烷烃的特性。通过基因组测序分析了烷烃降解机制。同时,本文还对西太平洋表层海水等其他环境中的深海弯曲菌进行了分离鉴定和多样性分析。生理生化结果表明,菌株Thalassolituussp.R6-15和4BN06-13均仅能利用少量的碳源,如Tween-40、Tween-80和乙酸,以及碳链长度为C8-C36的饱和烷烃。生长曲线测定表明,以十四烷为唯一碳源培养时,两株深海弯曲菌在15℃时,生长情况优于食烷菌SK2和B-5；利用十四烷为唯一碳源生长时,两株深海弯曲菌在15℃的生长情况好于25℃；但是,在利用乙酸钠为唯一碳源时,在25℃时生长更快。表明它们为耐冷菌。细胞表面疏水性分析表明,无论烷烃存在与否,也无论15℃还是25℃,菌株R6-15细胞表面疏水性优于食烷菌SK2,而比食烷菌B-5低。表面张力测定结果表明,在有烷烃诱导时,菌株R6-15在25℃能够将培养物的表面张力由59.43mN/m降低至49.09mN/m,但在15℃下不能降低培养物的表明张力值；在无烷烃诱导时,菌株R6-15不能降低培养物的表面张力值。细胞脂肪酸测定结果表明,菌株R6-15细胞中的主要脂肪酸组成为C14：0、C16：0和16：1w6c/16:1w7c;并且,无论有无烷烃诱导,不饱和脂肪酸(16:1w6c/16:1w7c)的含量在15℃培养时明显高于25℃处理。为了验证深海弯曲菌在低温下是否能够保持竞争优势,进行了竞争性生长实验。即,把菌株R6-15和4BN06-13分别与厦门表层海水的土著微生物或食烷菌放在以正十四烷为唯一碳源的培养基中,分别在在15℃和25℃共培养,观察的竞争性生长情况。结果表明,菌株R6-15与厦门表层海水菌群培养过程中,,均为25℃混合培养中占优势菌,并且,在15℃的优势更为突出；而菌株4BN06-13在25℃共培养菌群中,一直保持优势。在与A.jadensisT9共培养过程中,深海弯曲菌是优势菌株。菌株R6-15全基因组测序结果表明,该菌株仅包含一个环状染色体,大小为3,764,053bp,GC含量为46.6%,与模式菌株ThalassolituusoleivoransMIL-1(T)在全基因组序列水平上的相似性为96.92%,因此菌株R6-15属于Thalassolituusoleivorans。对基因组初步分析后发现,其基因组中包含两个烷烃羟化酶基因(alkB)和两个黄素单加氧酶基因(almA),且它们与模式菌株MIL-1中对应基因在氨基酸序列水平上的同源性大于99%。alkB和almA基因系统发育分析表明,来源于深海弯曲菌的这两类基因均各自形成一个独立的分支,暗示了它们进化的独立性。此外,在R6-15基因组中还发现了一系列可能与菌株冷适应性相关的基因,如冷休克蛋白(Csp)、与低温生长相关蛋白质折叠系统包括分子伴侣DnaK-DnaJ-GrpE、GroESL、ClpB和SecB,及冷休克Dead-box蛋白A(csdA)等基因。这些基因的存在,可能暗示着菌株R6-15中存在支持其在低温下生长的蛋白质折叠系统。为了获得更多深海弯曲菌属的可培养菌株资源,本文还分别从西太平洋表层海水石油烃富集菌群和厦门近海表层海水中分离获得了3株该属的菌株,16SrRNA基因系统进化结果表明,其中两株分离自西太平洋的菌株,与模式菌株ThalassolituusmarinusIMCC1826相似度分别为96.74%和96.80%,可能是该属的新种,它们低温下对烷烃的降解能力还有待验证。综上所述,本文首次对深海弯曲菌在低温和常温下利用烷烃的生长特性,并对它们烷烃降解及低温适应性机制进行了初步研究,研究结果将有助于理解深海弯曲菌在低温海洋环境石油烃降解菌群中保持优势的原因,为其在低温石油污染海洋环境的应用提供理论支撑。
【作者】陈昕；
【导师】邵宗泽；
【作者基本信息】厦门大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】深海弯曲菌；烷烃；生物降解；低温；降解机制；冷适应性；生物多样性；

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