EphrinB2对fas配体诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及机制探讨

【摘要】研究背景：近年来随着分子心血管病学的研究深入,越来越多的资料研究表明血管内皮细胞(VECs)凋亡可能通过多种途径启动并加速动脉粥样硬化(AS)的发生,发展过程。该凋亡途径主要通过fas通路诱导,Fas蛋白与Fas配体组成Fas系统,二者的结合导致靶细胞走向灭亡。因此,防止VECs凋亡,修复受损的VECs可以减缓初期AS进一步发展,保护VECs的药物也助于预防并治疗早期AS。ephrinB2作为一种促血管生成作用的生长因子,可能在VEGF信号通路中扮演一个总调控者的角色,并在血管生成中发挥核心作用。心梗动物模型显不,EphrinB2蛋白治疗能够抑制多种细胞凋亡,尤其是血管内皮细胞明显增多,促进血管生成,有望成为保护内皮细胞抗AS的新靶点。然而目前关于ephrinB2的促血管生成作用仅限于动物模型试验以及体外细胞增殖迁移等现象研究,它究竟是通过什么机制抑制内皮细胞凋亡,影响血管生成却鲜有报道。目的：检测ephrinB2蛋白对fas通路诱导的内皮细胞凋亡的影响,探讨ephrinB2蛋白抑制内皮细胞凋亡的可能机制。方法：将原代分离、培养的HUVEC细胞以rhfasl=7.5ng/ml,ephrinB2=0-2μg不等的剂量,据此将实验分为三组：control组,rhfasl诱导组,ephrinB2保护组(此组做ephrin=0,10,100ng及1,2μg/ml五个浓度),每组设6个复孔,对此三组行MTT或CCK8比较各处理组间细胞存活率的差异。其次对control组,rhfasl诱导组,ephrinB2保护组(上述检测最佳浓度点及时间点下)行流式凋亡实验检测,比较其凋亡率差异。再者,WesternBlot比较其在不同方式处理16h后的P-akt和Fas通路上caspase-3的表达量改变情况。机制探讨上,检测HUVEC细胞另一保护性通路蛋白P-erk表达情况。MEK阻断剂U1026阻断之与akt阻断剂aktil/2对]HUVEC细胞存活率的差异。结果：7.5ngrhfasl诱导HUVEC凋亡,细胞存活率明显低于对照组,细胞凋亡蛋白caspase-3表达量明显高于对照组(P<0.05或0.01,0.001),P-akt蛋白表达量明显低于对照组(P<0.05或0.01),ephrinB2干预后,和rhfasl组相比,细胞存活率明显升高,而caspase-3表达量显著降低(P<0.05或0.01),P-akt蛋白表达量明显低于对照组(P<0.05或0.01)。这表明,ephrinB2是具有促进Akt蛋白磷酸化的作用的。再者,WesternBlot检测内皮细胞是有P-erk表达的,靶向阻断MEK通路和akt通路,与DMSO组比较,MEK阻断剂U1026组无统计学差异(P>0.05),akt阻断剂akti1/2有统计学差异(P<0.05),该结果表明,ephrinB2保护内皮细胞免受凋亡的机制是通过P13K-akt通路而不是MEK/erk通路实现的。结论：ephrinB2蛋白可通过下调caspase-3蛋白表达而对抗fasl诱导的HUVEC凋亡这种抗凋亡机制是通过P-akt保护实现的。
【作者】陈小曼；
【导师】王挹青；
【作者基本信息】厦门大学，内科学，2014，硕士
【关键词】动脉粥样硬化；ephrinB2蛋白；fas通路；分子机制；

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