甘露糖受体及TLR4信号通路在尼古丁增强树突状细胞抗原交叉提呈中的作用

【摘要】树突状细胞(dendriticcell,DCs)是表达乙酰胆碱N型受体(nicotinicacetylcholinereceptor,nAchR)的抗原提呈细胞(antignpresentingcell,APC)。我们前期研究发现,尼古丁可调控小鼠骨髓来源的DCs表面nAchR及CD80/86等分子表达而增强DCs介导的CTL应答,尼古丁刺激DCs所表现的抗肿瘤效应提示尼古丁可调控DCs的交叉提呈能力。甘露糖受体(Mannosereceptor,MR)是DCs表面重要的模式识别受体,DCs对抗原的交叉提呈不仅依赖于MR介导的抗原内吞而且也依赖于TLR4通路活化所致的TAP内体转位。但到目前为止,尚不清楚MR及TAP内体转位在尼古丁调控DCs交叉提呈中作用,尼古丁对人DCs是否也有类似的调控作用也有待于进一步验证。为此,本课题先以流式细胞术、WesternBlot检测尼古丁对DCs表面MR,TLR4表达的影响；次以通路抑制剂阻遏相应激酶活性,流式细胞术、WesternBlot发现尼古丁调控MR、TLR4机制；继以激光共聚焦显微镜结合基因沉默技术观察MR、TLR4信号活化在尼古丁增强DCs交叉提呈中的作用；最后以人外周血单核细胞诱导DCs,进一步验证尼古丁对DCs表面分子的调控作用及其机制,为尼古丁调控DCs的临床应用提供理论基础。结果显示：尼古丁刺激不仅明显增加DCs表面MR和TLR4分子的表达并将DCs的吞噬能力提高约160%,而且也明显上调CD80和4-1BBL分子的表达,而nAchR特异性和非特异性拮抗剂α-银环蛇毒素和筒箭毒碱则明显逆转尼古丁对CD80、4-1BBL的上调作用,提示尼古丁经nAchR上调DCs表面MR、CD80、4-1BBL分子表达；对信号激酶磷酸化的检测显示,尼古丁在5-15分钟明显引起ERK1/2磷酸化,P13K激酶的磷酸化也在尼古丁刺激5-30分钟出现。而以LY294002和Wortmannin抑制相应激酶活性后,尼古丁对TLR4和MR分子的上调作用消失,提示尼古丁经PI3K-Akt通路上调DCs表面TLR4和MR表达；激光共聚焦显微镜观察显示,尼古丁刺激不仅增强OVA与早期内体标志分子EEA1共定位,也促进MR与EEAl的共定位,而MR基因沉默则显著抑制OVA-EEA1的共定位,提示尼古丁经调控MR表达而促进内吞抗原OVA定位于内体；对DCs交叉提呈产物SIINFEKL-H2Kb的激光共聚焦和流式细胞术检测则发现,尼古丁刺激不仅增加SIINFEKL与EEA1、Rab7、MHCI类分子共定位,也促进MHCⅠ类分子与EEA、Rab7的共定位和SIINFEKL-H2Kb复合物的形成,而沉默MR表达则SIINFEKL与EEA1、Rab7分子的共定位消失及SIINFEKL-H2Kb复合物的减少,提示尼古丁对DCs交叉提呈的增强作用依赖于MR介导的内吞抗原定位于内体；以LPS活化TLR4信号不仅明显增强TAP与EEA1、TAP与Rab7共定位,而且也显著增强SIINFEKL与EEA1、SIINFEKL与MHCI类分子及MHCⅠ类分子与EEA1的共定位及SIINFEKL-H2Kb复合物的形成,与MHCI类分子相反,MHCII类分子与SIINFEKL、Rab7共定位并不受到LPS影响。当以SiRNA转染沉默MyD88表达时,不仅LPS诱导的TAP内体转位明显降低,而且SIINFEKL与MHCI类分子于内体的共定位、SIINFEKL-H2Kb复合物的形成也明显降低,提示尼古丁对DCs形成SIINFEKL-MHCI类分子复合物的能力依赖于LPS诱导的MyD88介导的TAP内体转位；以人外周血来源的DCs进行的实验发现尼古丁通过nAchR-PI3K-Akt通路调控DCs表面nAchR、MR、TLR4、CD80、CD86、4-1BBL等分子的表达,尼古丁对DCs交叉提呈能力的增强作用也依赖于MyD88介导的TAP内体转位。综上所述：本课题发现了尼古丁调控DCs表面模式识别受体的规律,初步阐明了尼古丁增强DCs交叉提呈抗原的分子机制,为开展尼古丁刺激DCs的免疫治疗提供了理论依据。
【作者】王岩岩；
【导师】高丰光；
【作者基本信息】厦门大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】尼古丁；树突状细胞；交叉提呈；TLR4；CD206；

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