B7-2单克隆抗体对狼疮样肾炎小鼠模型的免疫干预效应及分子机制研究

【摘要】系统性红斑狼疮（systemiclupuserythematosus，SLE）是一种由自身反应性免疫细胞异常活化后产生自身抗体为特征的疾病。病变可累及全身，造成关节、皮肤、肾脏、心脏、肺、血管等各脏器和组织不可逆的慢性破坏和功能丧失。其中狼疮性肾炎（lupusnephritis，LN）是SLE最常见也是最严重的并发症，是导致患者死亡的主要原因。该病的病因至今尚无明确定论，可能与遗传及环境等多种因素有关。B7-2分子属于免疫球蛋白超家族成员之一，是抗原递呈细胞(antigenpresent-ingcell,APC)表面重要的协同刺激分子。其与表达于T细胞表面的CD28结合，介导T细胞活化、增殖、分化及发挥免疫效应。缺乏该信号，T细胞将进入无反应状态（Anergy）或免疫耐受（Tolerance）甚至引起程序性细胞死亡（Apoptosis）。研究发现，B7-CD28协同刺激信号参与了SLE的发生发展，并发挥着重要的作用。B7分子的特异性抗体可阻断或削弱B7-CD28信号，从而抑制免疫应答，因此通过应用B7-2抗体阻断或削弱B7-CD28通路有望为SLE提供新的生物治疗方法。本课题通过建立与人类SLE疾病相似的慢性移植物抗宿主病（cGVHD）狼疮样肾炎小鼠模型。运用自行研制的B7-2单克隆抗体对疾病模型进行干预，从免疫学，血清学，肾脏组织形态学等方面的指标来考察抗体对疾病模型的逆转效应及可能的分子机制。一、B7-2单克隆抗体的制备及鉴定目的：制备B7-2单克隆抗体并对其进行生物学特性鉴定。方法：应用本科室成功建立的稳定分泌B7-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D1，采用体内诱生腹水法制备单抗；ProteinG免疫亲和层析法纯化抗体；流式细胞术分析单抗对不同细胞膜型B7-2分子的识别。结果：经体内诱生腹水法制备B7-2单抗，小鼠腹水形成阳性率约为80%，腹水收获量平均为3ml/只小鼠；经免疫亲和层析法纯化，腹水中抗体蛋白的得率为3mg/ml；单抗与转人B7-2基因小鼠成纤维细胞株L929-B7-2、Daudi以及小鼠脾脏细胞的阳性结合率分别为99.3%、96.7%及61.2%。结论：B7-2单克隆抗体能够特异性识别不同细胞膜型B7-2分子。二、慢性移植物抗宿主病狼疮样肾炎小鼠模型的建立及病理性鉴定目的：对慢性移植物抗宿主病狼疮样肾炎小鼠模型进行免疫学、血清学及肾脏病理损伤鉴定。以考察该模型作为SLE疾病模型的可靠性。方法：将亲代雌性BALB/c小鼠脾脏细胞悬液经尾静脉注射(C57BL/J6×BALB/c)F1代小鼠，每隔3天注射1次，共4次。建模后1周，采用免疫荧光及流式细胞仪分析小鼠脾脏中抗原提呈细胞（APC）及抗体形成细胞的百分率。每隔2周检测血清中anti-dsDNA抗体及ANA；每隔4周检测尿蛋白量的动态变化；建模12周终止实验，取肾脏组织作HE染色观察病理改变，直接免疫荧光法检测免疫复合物（IC）沉积以及透射电镜观察肾小球超微结构变化。结果：流式细胞术的分析结果显示，造模后1周脾脏中膜型CD11b+、CD11c+及GR1+细胞的百分率较对照组明显升高（P<0.05），同时抗体形成细胞B220+表面CD21、CD23、CD80及CD86分子的表达均上调（P<0.05）；建模2周时，血清anti-dsDNA抗体出现阳性，4周时ANA出现阳性；12周时80%的小鼠存在蛋白尿，蛋白含量++~++++；肾小球体积增大并有大量炎性细胞浸润；肾脏IC沉积；透射电镜下可见肾基底膜节段性增厚，脏层上皮细胞和基底膜之间存在大量的电子致密物。结论：慢性移植物抗宿主病狼疮样肾炎小鼠模型具有人类SLE相似的免疫细胞异常活化及肾脏病理损伤的特征性表现，用于相关研究具有可靠性。三、B7-2单克隆抗体对狼疮样肾炎小鼠模型的免疫干预效应及分子机制的研究目的：探讨B7-2单克隆抗体通过阻断或削弱B7/CD28信号通路对狼疮样肾炎小鼠模型的免疫干预效应及可能的分子机制。方法：按第二部分的建模方法，取雌性BCF1代小鼠随机分为3组，模型组、抗体干预组及对照组，每组15只。干预组在末次注射淋巴细胞后的第1、3、5、8及15d分别尾静脉注射B7-2单抗(克隆1D1)8mg/kg，然后每月再注射1次，连续注射2次。模型组同一时间给予等剂量的小鼠Ig同型对照。分析脾脏中巨噬细胞（CD11b+）、树突状细胞（CD11c+）、中性粒细胞（Gr1+）的百分率及抗体形成细胞B220+细胞表面CD21、CD23、CD80及CD86分子的表达量，anti-dsDNA抗体、ANA含量，尿蛋白含量，免疫复合物，肾小球形态结构和超微结构改变等指标。结果：免疫荧光分析干预组小鼠CD11b+、CD11c+及GR1+细胞的百分率上调程度均低于模型组（p<0.05）；同时干预组B220+细胞表面CD21、CD23、CD80及CD86分子表达上调程度均低于模型组（p<0.05），提示B7-2单抗可以阻断或削弱B7/CD28信号通路，从而抑制机体的免疫应答；模型组90%的小鼠血清能检测到anti-dsDNA抗体和ANA的表达，干预组仅有40%，且干预组的血清抗体滴度明显低于模型组；12周时80%的模型组小鼠存在蛋白尿，蛋白含量++~++++，20%的干预组小鼠存在蛋白尿，蛋白含量为+~++；模型组肾脏组织切片HE染色显示肾脏出现肾小球肿胀，淋巴细胞浸润等典型的炎性改变，干预组肾小球体积轻度增大，少许淋巴细胞浸润，毛细血管腔及球囊腔体积基本正常，两组相比较，干预组肾脏病理学改变轻于模型组；荧光显微镜检查发现模型组肾小球IC沉积，与模型组相比，干预组沉积在肾小球上的IC少于模型组；透射电镜超微结构检查发现模型组基底膜节段性增厚，内皮下大量电子致密物沉积等病理改变，与模型组相比，干预组基底膜厚度均匀，病理改变较轻。结论：B7-2单克隆抗体通过阻断或削弱B7/CD28信号可降低免疫细胞的异常活化，减少自身抗体的产生从而减轻免疫复合物对肾功能的损伤。因此B7-2单克隆抗体的免疫干预可逆转狼疮样肾炎小鼠的病理损伤，提示其对此类疾病具有潜在的治疗效应。
【作者】韩莲花；
【导师】邱玉华；
【作者基本信息】苏州大学，免疫学，2014，硕士
【关键词】B7-2分子；单克隆抗体；慢性移植物抗宿主病；狼疮样肾炎；免疫干预；

【参考文献】
[1]任立,杨学良.CallCenter/CRM模型在保险行业的应用[J].工业控制计算机,2002,08:1-3.
[2]朱敏.我国上市公司内部审计质量相关问题研究[D].南京财经大学,会计学,2011,硕士.
[3]李甜甜.青年旅舍环境设计特色研究[D].山东工艺美术学院,艺术设计,2014,硕士.
[4]裴艳云.基于GeoGIS的数字地质调查系统的研建[D].北京林业大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[5]肖娟娟.rs4938723、rs7372209与ESCC易感性的研究及SULT1A1 Arg213His多态性与癌症易感性的Meta分析[D].苏州大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[6]敖然.基于企业内容管理平台的文档管理系统的设计与实现[D].北京交通大学,2013.
[7]王荣辉.基于C/S结构的企业信息管理系统的研究与应用[D].合肥工业大学,2004.
[8]杨梦瑶.区域经济发展与环境治理的评价与应用[D].长安大学,行政管理,2014,硕士.
[9]肖慧玲.KT公司研发部薪酬优化研究[D].华中师范大学,工商管理,2012,硕士.
[10]苏春.大学语文：“读研写演”生态情景式教学模式研究[D].湖南师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[11]曹磊.miR-214在膀胱癌血管新生过程中的作用和机制研究[D].华中科技大学,外科学,2013,硕士.
[12]石范锋,万能.基于ASP.NET的志愿者管理信息系统设计与实现[J].软件导刊,2015,04:92-93.
[13]刘秋妍.无线网络同信道干扰性能分析方法研究[D].北京交通大学,2012.
[14]徐绮阳.安徽省区域间经济竞争力评价[D].兰州商学院,区域经济学,2013,硕士.
[15]梁峰.LED前雾灯设计研究[D].南京理工大学,车辆工程,2013,硕士.
[16]许吓毜.魏仲南主任医师治疗慢性肾衰病经验总结[D].福建中医药大学,中医内科学（专业学位）,2013,硕士.
[17]周伍阳,杨招军.纳税人诚信识别系统设计的方法与模型研究[J].电脑开发与应用,2005,07:2-3+6.
[18]陈健康.紫外辐射改性碳材料对水中重金属的吸附研究[D].重庆大学,市政工程,2014,硕士.
[19]马竹梧.第3届中国国际高新技术成果交易会在深圳举行[J].冶金自动化,2002,02:65.
[20]李志康.磺胺间甲氧嘧啶对鸡肉营养品质的影响[D].河南科技大学,食品科学,2013,硕士.
[21]刘德武.物探在河北团榆树金矿找矿中的应用[D].石家庄经济学院,矿产普查与勘探,2012,硕士.
[22]娄丽群.马克思人的全面发展理论及其当代价值[D].内蒙古大学,马克思主义理论,2014,硕士.
[23]刘海斌.《糖厂10月开榨配套技术开发》的评价[D].中国农业大学,种植业,2004,硕士.
[24]辛璐璐.动力荷载作用下多自由度结构非线性恢复力识别研究[D].湖南大学,结构工程,2013,硕士.
[25]刘美云.基于种群分布模型学习的班德文进化多目标优化算法[D].西安电子科技大学,计算机应用技术,2012,硕士.
[26]琴裕贞.中、韩大学生价值观与服装消费行为比较研究[D].浙江大学,2010.
[27]李琰.分布式发电系统中光伏发电稳定性仿真研究[D].天津大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[28]陶双利.上海城投控股管理控制信息化系统设计与实现[D].大连理工大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[29]郭巧例.北方航空公司商务人员培训与发展系统研究[D].大连理工大学,工商管理,2003,硕士.
[30]徐昭远.α-Fe_2O_3薄膜的制备以及掺杂Ta对其光电特性的影响[D].华东理工大学,化学工程,2014,硕士.
[31]曲广波,刘思金.氧化石墨烯通过破坏细胞骨架和氧化应激途径诱导巨噬细胞凋亡和功能损伤[A].中国化学会.中国化学会第28届学术年会第2分会场摘要集[C].中国化学会:,2012:1.
[32]刘佳.上市公司董事会特征对会计稳健性的影响研究[D].西南大学,会计学,2013,硕士.
[33]王晓明.Retinex理论在汽车牌照识别系统中的研究及应用[D].西安电子科技大学,交通信息工程及控制,2012,硕士.
[34]邓宁宁.四轮转向四轮独立驱动车辆协调控制研究[D].哈尔滨工业大学,车辆工程,2014,硕士.
[35]单晓磊.基于嵌入式技术的经纬仪数据通讯系统的设计与实现[D].中国科学院研究生院(长春光学精密机械与物理研究所),光学工程（专业学位）,2013,硕士.
[36]李乐.高Pr数流体在不同肋排列三维内肋管中热力性能研究[D].重庆大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2003,硕士.
[37]廖洁月.淫羊藿素对系统性红斑狼疮Foxp3/IL17a调控作用与分子机制及其治疗MRL/1pr狼疮鼠的实验研究[D].中南大学,临床医学,2014,博士.
[38]齐嘉,傅骞.Web信息抽取技术在智能WAP网关中的应用[J].电信科学,2005,07:54-56.
[39]柳剑.制造系统运行可靠性分析与维修保障策略研究[D].重庆大学,2014.
[40]古国伟.涂层烘干设备安全评价研究[D].华南理工大学,项目管理,2012,硕士.
[41]王继民.基于物理过程的水流仿真[D].河海大学,计算机应用技术,2003,硕士.
[42]张芳枝.强风化泥质软岩的工程特性及其本构模型参数试验研究[D].河海大学,水利工程,2003,硕士.
[43]陈冲.基于CRR模型的多维资产期权定价[D].华中师范大学,应用数学,2013,硕士.
[44]辛策.应用盘钻行小型猪上颌窦内提升同期种植体植入术的影像学研究[D].青岛大学,口腔临床医学,2013,硕士.
[45]梁振锋,康小宁,索南加乐,杨晓萍.适用于发展性故障的故障分量提取算法[J].电力系统自动化,2007,06:44-47.
[46]方勇杰,鲍颜红,徐泰山,徐伟.人工紧急调控与自动紧急控制协同防御[J].电力系统自动化,2012,22:6-11.
[47]苗蔚,李后卿.知识发现及其实现技术的研究概述[J].现代情报,2005,01:12-15.
[48]罗洁琪.外资并购反垄断法律控制[D].中国政法大学,法律,2004,硕士.
[49]孙晶.大学变革中的组织惯性问题研究[D].浙江工业大学,2012.
[50]念达,于润泽,王引书,刘斌,李兰秀.倒扣在水中的容器内燃烧蜡烛的熄灭及相关现象的研究[J].大学物理,2015,03:50-55.