洋葱假单胞菌脂肪酶化学修饰及其对手性伯醇立体识别机理研究

【摘要】本文以洋葱假单胞菌脂肪酶(Pseudomonascepacialipase,PcL)为研究对象,通过对PcL动力学拆分不同结构手性醇及其乙酸酯,最终确定以手性伯醇动力学拆分为模型反应,以PcL对伯醇立体识别机理解析为目标,通过化学修饰、蛋白质谱解析和分子动力学模拟相结合方法研究了PcL识别含非酯键氧原子手性伯醇的对映体选择性识别作用机制-氢键作用。主要内容如下：考察PcL催化不同结构手性醇(仲醇和伯醇)及其乙酸酯动力学拆分对映体选择性。结果表明PcL对手性仲醇具有非常好的选择性。而对于伯醇,PcL催化对映体选择性与底物结构有很大关系,且PcL对结构中含有非酯键氧原子的底物对映体选择性显著高于不含氧原子的底物。采用不同修饰剂修饰PcL特定氨基酸残基,考察了化学修饰对PcL催化手性伯醇酯水解选择性影响。发现Tyr残基被修饰的PcL对含有非酯键氧原子的手性伯醇酯选择性显著改变,并且靠近活性中心的Tyr酚羟基与伯醇非酯键氧原子形成氢键能力越强,PcL对其对映体选择性越高。对PcL酪氨酸残基修饰进行修饰动力学研究,及通过圆二色谱、MALDI-TOF质谱表征修饰脂肪酶的结构。圆二色谱结构表征结果显示Tyr修饰脂肪酶二级结构发生一定变化,MALDI-TOF质谱分析表明这一作用机制中起关键作用的位点为位于催化活性口袋中的Tyr29。分子动力学模拟研究证实只有当PcL的Tyr29酚羟基氧原子与底物2结构中非酯键氧原子形成额外的氢键时,PcL才能很好地识别R构型对映体,反应具有较好的选择性,从而首次成功解释了脂肪酶对手性伯醇立体识别的独特机理。并且其研究方法借助独立于分子生物学之外的化学修饰方法,结合蛋白质谱解析和分子动力学模拟等现代技术手段,开创了一条崭新的灵活、高效、可靠的酶构效关系研究。
【作者】周勤丽；
【导师】杨立荣；徐刚；吴坚平；
【作者基本信息】浙江大学，生物化工，2013，硕士
【关键词】洋葱假单胞菌脂肪酶；化学修饰；手性伯醇；分子动力学；对映体选择性机理；

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