重组人胰岛素样生长因子-1在大肠杆菌中的高效表达和分离纯化

【摘要】胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowthfactor,IGF-1)不仅具有调节细胞糖代谢的功能,还是生物体内重要的生长因子,广泛应用于无血清培养和医学临床治疗领域。IGF-1在血清中含量极低,直接从动物血液中提取IGF-1操作复杂、成本高、易被病原微生物污染。本文的主要目的是通过基因工程方法高效生产具有生物活性的hIGF-1蛋白质。本研究首先将hIGF-1连接到pET32a(+)表达载体上,再通过定点突变方法删除hIGF-1基因序列前由pET32a(+)载体引入的两个多余氨基酸基因序列。然后将重组质粒转入宿主菌E.coliRosetta(DE3)中,成功构建表达系统E.coliRosetta(DE3)/pET32-hIGF-1-M。之后,在摇瓶条件下研究优化诱导表达条件,包括：诱导时机、诱导后培养温度、诱导剂浓度和诱导后培养时间。最优诱导条件为：在重组菌对数生长期中期加入0.6mMIPTG,在34℃下诱导表达6h,摇瓶条件下融合蛋白TrxA-hIGF-1产量达1.86g/L通过Ni-NTA亲和层析纯化,获得了高回收率(80%)、高纯度(94%)融合蛋白TrxA-hIGF-1.之后,经肠激酶裂解TrxA-hIGF-1和Ni-NTA亲和层析获得了高纯度(90%)的成熟hlGF-1。在10L发酵罐中以甘油为碳源对表达体系放大培养,分别进行批次发酵和补料-分批发酵。补料-分批发酵较批次发酵发酵周期缩小10h,产量更高,更适合工业化生产。融合蛋白TrxA-hIGF-1在补料-分批发酵中产量最大达到11.7g/L。最后,使用成纤维细胞NIH/3T3测定所制备hIGF-1的生物活性,结果表明,hIGF-1样品,与对照细胞株相比,能够刺激活细胞总量提升30%。
【作者】宗超；
【导师】徐志南；
【作者基本信息】浙江大学，生物化工，2013，硕士
【关键词】胰岛素样生长因子-1；高效表达；亲和层析；高密度发酵；

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