不同来源5-氨基乙酰丙酸合成酶的表达、酶学性质研究及其应用

【摘要】5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinicacid,ALA)是生物合成卟啉、叶绿素、亚铁血红素和维生素B12等四吡咯化合物的共同前体物质,广泛存在于微生物、植物和动物细胞中。ALA的应用非常广泛,除作为一种环境相容性和选择性很高的新型除草剂和农药外,还作为光动力学药物用于癌症的光动力学诊断和治疗。本工作以外源基因的来源为出发点,利用来源不同的5-氨基乙酰丙酸合成酶之间的性质差异,以期筛选得到一种酶学性质优良并可在大肠杆菌体内高活性表达的酶,为ALA的高效生产奠定良好的基础。本文首先克隆并表达了4个分别来源于荚膜红细菌(R.capsulatus)、大豆根瘤菌(B.japonicum)、嗜酸柏拉红菌(R.acidophilus)、脱氮副球菌(P.denitrificans)的编码5-氨基乙酰丙酸合成酶的hemA基因,并对上述hemA基因在大肠杆菌E.coliRosetta(DE3)中的表达情况、重组酶的比活力和发酵情况等方面进行了比较。结果表明,含有荚膜红细菌hemA基因的工程菌E.coliRosetta(DE3)/pET28a-RC.hemA表现出更好的合成ALA的潜力。通过亲和层析和凝胶过滤层析,制备得到重组酶RC-ALAS纯品。以放射形土壤杆菌(A.radiobacterzju-0121)和类球红细菌(R.sphaeroides)的hemA基因所表达的AR-ALAS和RS-ALAS为参照,研究了RC-ALAS的酶学性质。结果表明,RC-ALAS酶活高达198.2U/mg,比AR-ALAS(151.1U/mg)和R.S.-ALAS(116.9U/mg)分别提高31.2%和69.5%；三者的最适温度均为37℃,最适pH均为7.5,其中,RC-ALAS对pH更为敏感,其余两者对温度更为敏感；金属离子、EDTA和SDS对三者酶活的影响基本一致；RC-ALAS的专一性常数(kcat/Km)S-CoA值为1.4989,高于AR-ALAS(0.7456)和RS-ALAS(1.1699)。最后,在15L发酵罐上对重组菌E.coliRosetta(DE3)/pET28a-RC.hemA进行发酵。发酵结束时,ALA的产量高达8.8g/l,证实了工程菌E.coliRosetta(DE3)/pET28a-RC.hemA具有大量积累ALA的能力。
【作者】漏佳伟；
【导师】林建平；
【作者基本信息】浙江大学，生物化工，2014，硕士
【关键词】5-氨基乙酰丙酸合成酶；基因来源；酶学性质；高活性表达；

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