猪精液液态保存长效稀释液的研制及其冷冻保存的研究

【摘要】猪精液的保存有液态保存和冷冻保存两种，目前在生产实践中应用的仍为液态保存中的常温保存。由于常温保存的有效存活时间短，低温和冷冻保存在技术上还不成熟，因此大大限制了猪人工授精技术和良种猪的推广应用，也成为国内外学者一直热衷研究的领域。为了延长猪精子的有效存活时间，提高种公猪的繁殖效率，推动猪人工授精技术和生猪生产的发展，本试验以保存猪精液的稀释液为重点对其常温保存和低温保存进行了研究，并在此基础上对猪精液的冷冻保存也进行了研究。在常温(17℃)保存研究中，试验就基础稀释液Tris－柠檬酸－葡萄糖稀释液I-VI（TCGI-VI）和两种红细胞保存液(CPDA-1和MAP）、添加成分（SLX、SSX、腺嘌呤和SOD）及其添加量以及SLX和SSX的配合应用对猪精液常温保存的活率、有效存活时间和总存活时间的影响进行了研究。研究结果表明：（1）TCGIII稀释液和TCGI稀释液都极显著优于MAP液和CPDA-1液（P＜0.01），有效存活时间TCGIII稀释液和TCGI稀释液分别为9.30±1.10d和8.30±2.49d，而MAP液和CPDA-1液则仅为1.70±0.84d和0.50±0.34d。六种TCG稀释液（I-VI）比较，从总存活时间来看，TCGIII﹥TCGII﹥TCGI﹥TCGIV﹥TCGV﹥TCGVI；从有效存活时间来看，TCGIII﹥TCGII﹥TCGIV﹥TCGI﹥TCGV﹥TCGVI。（2）TCGIII稀释液中添加SLX、SSX、腺嘌呤或SOD后，SLX可明显延长猪精子的有效存活时间（P＜0.05），添加SLX组的有效存活时间为10.80±2.28d，对照组的有效存活时间则为8.20±1.95d；而添加SSX、腺嘌呤和SOD则不能显著延长猪精子的有效存活时间（P＞0.05﹚。就SLX的添加剂量来看，有效存活时间和总存活时间3.0mg/mL组﹥1.5mg/mL组﹥0.75mg/mL组﹥0.4mg/mL组﹥6.0mg/mL组。添加量为3.0mg/mL时，有效存活时间和总存活时间都最长，有效存活时间为12.9±3.58d，总存活时间为16.5±1.73d。就SSX的添加剂量来看，精子的有效存活时间40μg/mL组和75μg/mL组显著高于150μg/mL组和300μg/mL组（P＜0.05﹚，而40μg/mL组与75μg/mL组之间以及150μg/mL组与300μg/mL组之间则均没有明显差异（P＞0.05﹚。有效存活时间75μg/mL组﹥40μg/mL组﹥150μg/mL组﹥300μg/mL组。从精子的总存活时间来看，40μg/mL组和75μg/mL组明显长于300μg/mL组（P＜0.05﹚，40μg/mL组与75μg/mL组和300μg/mL组与150μg/mL组比较，则差异不明显（P＞0.05﹚。总存活时间40μg/mL组﹥75μg/mL组﹥150μg/mL组﹥300μg/mL组。（3）与单纯添加SLX或SSX相比，同时添加SLX和SSX虽然不能明显延长猪精子的有效存活时间和总存活时间（P＞0.05﹚，但在精液保存的8-13天精子活率的下降明显较慢，8天前和13天后，则与单纯添加SLX或SSX相近。（4）试验对保存6-12天的猪精子的顶体完整率进行了检查，结果发现TCGIII基础稀释液中添加SLX（1.5mg/mL）、SSX（75μg/mL）或SLX+SSX后，顶体的完整率均在80%以上。在常温保存研究的基础上，试验就基础稀释液TCG(I–VI)、添加成分（SLX、SSX、腺嘌呤和SOD）及SSX的添加量对猪精液低温（4℃）保存的活率、有效存活时间和总存活时间的影响也进行了研究。结果表明：（I）六种TCG稀释液中，配方TCGIII最好，有效存活时间可达7.30±1.30d，极显著优于配方TCGV和TCGVI（P＜0.01），显著优于配方TCGI和TCGIV（P＜0.05）；有效存活时间TCGIII﹥TCGII﹥TCGI﹥TCGIV﹥TCGVI﹥TCGV。从总存活时间来看，配方TCGI和TCGII最好，总存活时间分别为7.30±1.30d和8.5±1.58d，极显著优于配方TCGV和TCGVI（P＜0.01），显著优于配方TCGIV（P＜0.05）；总存活时间TCGI﹥TCGII﹥TCGIII﹥TCGIV﹥TCGVI﹥TCGV。（II）在TCGIII稀释液的基础上，添加SLX、SSX、腺嘌呤或SOD后，与对照组相比（6.6±0.51d；8.5±0.71d），无论是有效存活时间还是总存活时间，添加SLX、腺嘌呤和SOD都不能得到明显延长（P＞0.05）；而唯有SSX则能极显著延长猪精子的有效存活时间（12.90±1.14d）和总存活时间（14.90±1.95d）（P＜0.01）。SSX对低温保存猪精子有效存活时间和总存活时间的影响具有剂量相关性，随着SSX添加剂量的增加，低温保存猪精子的有效存活时间和总存活时间会出现延长。有效存活时间和总存活时间都是300μg/mL组最长，40μg/mL组最短，75μg/mL组和150μg/mL组间于二者之间。以TCGIII为基础稀释液，试验还就甘油浓度、解冻温度和时间以及SSX对猪精液冷冻（液氮）保存的影响进行了研究。从研究结果可知，（a）甘油浓度为4%时，猪精子冻后的存活率最高，达0.49±0.05，极显著高于2%甘油浓度时的冻后存活率（P＜0.01﹚，明显高于3%甘油浓度时的冻后存活率（P＜0.05﹚。（b）就解冻温度和时间来看，37℃30s组和65℃5s组猪精子的冻后存活率显著高于4℃60s组（P＜0.05﹚，37℃30s组和65℃5s组猪精子的冻后存活率分别为0.43±0.06和0.45±0.06。（c）与对照组相比，冷冻稀释液中添加SSX并不能显著提高猪精子的冻后存活率（P＞0.05﹚，表明在猪精液的冷冻保存稀释液中添加SSX不能提高冻后猪精子的存活率。
【作者】凌培凤；
【导师】郝志明；
【作者基本信息】天津农学院，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】猪精液；常温保存；低温保存；冷冻保存；稀释液；活率；存活时间；

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