通过斑马鱼模型研究霍乱弧菌致病相关基因对其在中间宿主肠道定殖能力的影响

【摘要】霍乱弧菌(V.cholera)是一种革兰氏阴性、兼性厌氧、水生的弧菌,同时也是人类烈性传染病霍乱的病原体。目前对霍乱弧菌在实验室条件和致病条件下基因表达调控的研究较为详细,但对其在自然水体中的生存情况及相关基因的表达调控研究较少,主要是由于缺少合适的模型。霍乱弧菌在淡水中一般不能独立生活,需要附着在水生动、植物体表才能生存,因此鱼类可能是霍乱弧菌的中间宿主之一。而斑马鱼(Daniorerio)模型是研究与动物相关的微生物在活体条件下生长或致病的一种相对简单和方便的动物模型。为了建立斑马鱼模型研究自然条件下霍乱弧菌的生存和定殖情况,本文将斑马鱼放在含有约1×105CFU/mL霍乱弧菌的水中,发现霍乱弧菌在24h内就能在斑马鱼的肠道中定殖。首先,通过霍乱弧菌毒力调控相关基因的缺失突变株与野生型菌株的竞争定殖实验,发现△luxO和△aphA突变株的竞争系数与其它突变株相比差异最大,分别为0.122和7.655,说明这两个基因的缺失对霍乱弧菌在斑马鱼体内定殖能力影响最大；但是在乳鼠模型中,aphA的缺失突变株在肠道定殖的能力小于野生型菌株。同时与群体感应相关基因的缺失对霍乱弧菌在斑马鱼模型中定殖能力的影响远远小于在乳鼠模型中,因此毒力调控相关基因的缺失对霍乱弧菌在斑马鱼体内定殖能力的影响较小其次,在单独定殖实验中,△toxT突变株的定殖数量与野生型菌株相当,说明毒素共调节菌毛(TCP)并没有在斑马鱼体内表达,因此对其在斑马鱼体内定殖没有影响,这是与霍乱弧菌在乳鼠小肠中定殖时区别最大的地方,推测霍乱弧菌在斑马鱼体内定殖以生存、增殖为主要目的。综合比较基因缺失突变株和野生型菌株在单独和竞争定殖实验中的定殖情况,发现△hapR突变株(该菌株在两种情况下定殖数量没有显著性差异)在竞争定殖实验中使野生型菌株的数量比其在单独定殖时增加了11倍；而野生型菌株(该菌株在两种情况下定殖数量没有显著性差异)使△aphB突变株的数量比单独定殖时下降了54倍。说明不同基因的缺失对霍乱弧菌在中间宿主体内与其它菌株的竞争时产生不同的影响,这对揭示霍乱弧菌在自然条件下的生存机制提供了新的思路。最后,本文选取了LuxR家族、LysR家族以及胞外蛋白酶家族中一些基因缺失突变株,研究它们在斑马鱼体内定殖的能力。结果发现LuxR家族的vc1277基因缺失突变株在斑马鱼体内定殖能力比野生型菌株提高了4.548倍,且有研究表明斑马鱼肠道能产生AHLs类信号分子,该分子是LuxR蛋白的诱导物,它可与LuxR蛋白结合从而影响其下游基因的表达。在LysR家族蛋白中,△oxyR突变株在单独接种实验中的定殖数量比野生型菌株降低了约16倍,但是当二者竞争定殖时,△oxyR突变株与野生型菌株的定殖数量无显著性差异,而相同的试验在乳鼠模型下则没有任何差异,说明OxyR调控氧代谢相关基因的表达对霍乱弧菌在斑马鱼体内抵抗ROS的过程中发挥了作用。而在胞外蛋白酶基因缺失突变株中,基因vc0524、vca0849和vca0812编码的蛋白酶对于霍乱弧菌在斑马鱼体内定殖起到了抑制作用。同时,△prtV突变株在水体中比野生型菌株降低了约83倍,表明该金属蛋白酶对霍乱弧菌在自然水环境的生存中发挥了极大的作用。综上所述,本文揭示了在斑马鱼模型中影响霍乱弧菌在宿主体内定殖能力的基因与在乳鼠模型下存在较大的差异,并且这些基因与致病性没有直接关系。因此该模型对研究霍乱弧菌在中间宿主体内的生存繁殖具有重要意义,为筛选在自然条件下影响霍乱弧菌生存的重要基因提供研究平台。
【作者】蒋湉湉；
【导师】钟增涛；朱军；
【作者基本信息】南京农业大学，微生物学，2013，硕士
【关键词】霍乱弧菌；斑马鱼模型；定殖；毒力基因；

【参考文献】
[1]陈文晔.基于GPS/GPRS的邮政通信运输管理系统研究[D].西安电子科技大学,计算机技术,2010,硕士.
[2]周方艮.浅析孔板流量计量程比[J].冶金自动化,2010,05:57-60.
[3]王伟.基于无线电测向技术的弹载记录仪信标研制[D].中北大学,测试计量技术及仪器,2014,硕士.
[4]吴玲,宋天铭,宋铖,冯泽猛,何婧琳,曹忠.一种高灵敏检测尿酸的聚阳离子纳米复合膜电化学传感器[A].中国化学会.中国化学会第29届学术年会摘要集——第04分会：纳米生物传感新方法[C].中国化学会:,2014:1.
[5]李莹.汉语在乌兰巴托进一步推广的不利因素及对策[D].吉林大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[6]于剑,徐彬.面向客流分配的城市轨道交通服务网络建模方法研究[J].城市轨道交通研究,2014,09:92-95+104.
[7]张云飞.养老社会化视角下完善河南省养老服务体系的路径选择[D].郑州大学,社会保障,2013,硕士.
[8]杨朝霞.紫甘薯花色苷色素提取纯化工艺研究及组分分析[D].青岛大学,应用化学,2004,硕士.
[9]王奥.吉林省农业保险发展对策研究[D].吉林农业大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[10]何历.桌面监控系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[11]于贞.中青年屈光不正人群中散光来源的分析[D].大连医科大学,眼科学,2012,硕士.
[12]任秀明.水热法生长ZnO纳米结构研究[D].大连理工大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[13]夏冰冰.基于彩色结构光的三维立体视觉方法研究[D].浙江工业大学,2006.
[14]李朝霞.有限群与两类关联结构[D].杭州电子科技大学,基础数学,2012,硕士.
[15]李涛,曲军彪,周彦军.深基坑降水对周围建筑物沉降的影响[J].北京工业大学学报,2009,12:1630-1636.
[16]陈晓丽.中国企业OFDI进入模式对经营绩效的影响[D].山东大学,国际贸易学,2013,硕士.
[17]王宇洁.适应素质教育的小学校园儿童游戏空间形态探析[D].西安建筑科技大学,建筑设计及其理论,2004,硕士.
[18]牛巨辉.我国上市公司退出机制及相关问题研究[D].沈阳工业大学,会计学,2003,硕士.
[19]李嘉.集群通信系统接收前端分路器的设计[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[20]狄帮让,熊金良,岳英,魏建新,薛广建,顾培成.面元大小对地震成像分辨率的影响分析[J].石油地球物理勘探,2006,04:363-368+492+355.
[21]张蔷.认知功能训练对脑卒中后血管性认知障碍的临床研究[D].黑龙江中医药大学,康复医学与理疗学,2014,硕士.
[22]全海燕,韦秀波,郭毅,刘原英.利用地震道头数据进行深海拖缆数据采集质量控制技术[J].石油地球物理勘探,2009,06:651-655+783+643.
[23]刘协鲁.陕西凤县柴蚂金矿床地质地球化学特征及成因研究[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2014,硕士.
[24]魏延蛟.男性幼儿教师职业幸福感叙事研究[D].山西师范大学,教育经济与管理,2014,硕士.
[25]姚菊芳.山西繁峙方言代词研究[D].山西师范大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[26]徐德忠,邓明纫.8mm照射雷达发射信号相位噪声的测试[J].宇航计测技术.1992(05)
[27]尹建宝.吸烟对汉族类风湿关节炎患者抗CCP抗体及疾病活动的影响的研究[D].山东大学,内科学（专业学位）,2012,硕士.
[28]康红莉.祁连山林区土壤水分生态研究[D].甘肃农业大学,森林经理学,2003,硕士.
[29]王新君.PKM2在膀胱尿路上皮癌中的表达及其对膀胱癌细胞糖代谢和生物学行为的影响[D].中南大学,临床医学,2014,博士.
[30]张丽娜.我国流通业产业安全评价及预警模型研究[D].兰州商学院,产业经济学,2014,硕士.
[31]毕恺韬.适用于抽水蓄能机组的SCR静止变频器控制策略研究[D].哈尔滨工业大学,电机与电器,2014,硕士.
[32]钟飞.挖掘机破碎作业工作装置动态特性及疲劳分析[D].太原科技大学,车辆工程,2013,硕士.
[33]潘伟轩.纯电动车用双电池并联混合能源管理系统研究[D].河北大学,仪器仪表工程,2014,硕士.
[34]邓顺柳,谢素原,黄荣彬,郑兰荪.富勒烯形成机理的研究进展[J].中国科学:化学,2012,11:1586-1596.
[35]徐淑合.提高深层下传能量地震采集方法研究[D].中国海洋大学,地质工程,2003,硕士.
[36]覃松.基于ABAQUS软件的道路减速设施的仿真分析[D].重庆交通大学,交通运输工程,2012,硕士.
[37]陈晓蕾.共聚法合成阴离子型聚丙烯酰胺石油驱油剂的研究[D].西北工业大学,材料学,2004,硕士.
[38]徐昭远.α-Fe_2O_3薄膜的制备以及掺杂Ta对其光电特性的影响[D].华东理工大学,化学工程,2014,硕士.
[39]生潇.我国军事复权制度的构建[D].吉林大学,法学,2014,硕士.
[40]史文俊.软件开发过程在客户关系管理中的应用[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[41]陈超伟.柔性张拉整体结构振动最优控制及作动器优化配置[D].西安电子科技大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[42]石文荣.新型还原剂制备石墨烯[D].南昌大学,2014.
[43]郑晓.基于货车制动性能的长大下坡行车风险分析及防控措施[D].长安大学,道路与铁道工程,2014,硕士.
[44]陈丹.论中国共产党党报文风理论[D].华中科技大学,新闻学,2013,硕士.
[45]崔泽峰.基于项目聚类和用户兴趣的个性化推荐系统研究[D].燕山大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[46]荆云鹏.基于J2EE在线学习平台的设计与实现[D].西安电子科技大学,计算机系统结构,2011,硕士.
[47]李丽霞.内蒙古银行个人金融业务发展战略研究[D].内蒙古大学,工商管理,2013,硕士.
[48]付军.株洲硬质合金集团质量管理体系标准实施研究[D].湖南大学,工商管理,2003,硕士.
[49]彭若弘,高有典.建立电信运营企业综合资产动态闭环管理体系[J].通信企业管理,2004,03:42-44.
[50]邢桂磊.Ghrelin改善重复性力竭运动大鼠全身炎症反应的研究[D].天津体育学院,运动人体科学,2014,硕士.