赭曲霉毒素A单链抗体的制备及初步应用

【摘要】赭曲霉毒素A(OchratoxinA,OTA)是饲料和食品中污染较多、分布较广的真菌毒素之一。近年来,对赭曲霉毒素A检测方法的研究正不断深入。高效液相色谱法和免疫学检测法是目前赭曲霉毒素A的常用检测方法。与高效液相法相比,免疫学检测法具有经济、快速、操作简便等优势,灵敏度相当或更高,对检测样品的纯度要求不高,因而特别适用于大批量样品的检测。传统的免疫学检测法主要通过多克隆抗体或单克隆抗体构建,由于多克隆抗体的成分复杂,制备成本高昂且质量不稳定,单克隆抗体虽特异性强,多样性却较差,因而使免疫学检测技术的发展受到了限制。相比之下,单链抗体具有相对分子量小、组织穿透力强、特异性强、表达形式多样、表达量大且生产成本低廉等优点,近年来的研究正日益增多。本研究以赭曲霉毒素A为对象开展实验,从免疫小鼠的脾细胞内扩增出抗体可变区的全套基因,通过基因工程技·术,获得OTA单链抗体,并初步建立了饲料中OTA毒素的免疫学检测方法,为构建检测试剂盒提供参考和依据。试验Ⅰ赭曲霉毒素A偶联抗原的制备采用活性酯法合成OTA-KLH偶联抗原作为免疫抗原,碳二亚胺法合成OTA-OVA偶联抗原作为包被抗原；采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和紫外扫描法对偶联抗原进行分析；采用间接ELISA方法检测OTA-OVA偶联抗原的反应原性；OTA-KLH偶联抗原免疫小鼠以检测其免疫原性。结果显示,考马斯亮蓝法测得OTA-KLH浓度为6.6139g-L-1,OTA-OVA浓度为2.3543g.L-1；两种抗原均偶联成功,但KLH蛋白由于分子量较大,SDS-PAGE并不适用于该偶联物偶联效果的分析；OTA-KLH的偶联比为14：1,OTA-OVA的偶联比为9：1；间接ELISA结果显示,OTA-OVA偶联抗原具有良好的反应原性；小鼠免疫实验结果显示,OTA-KLH偶联抗原具有较高的免疫原性,血清效价检测结果说明,免疫小鼠的脾脏满足后续实验的要求。试验Ⅱ赭曲霉毒素A单链抗体的制备提取小鼠脾细胞总RNA,RT-PCR合成cDNA第一条链,设计合适的引物分别扩增出OTA单链抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,经过三个步骤合成以VL-Linker-VH形式相连的ScFv片段；将ScFv片段插入pCANTAB5E载体,导入大肠杆菌TGl中,以OTA-OVA偶联抗原作为包被抗原,应用噬菌体展示技术进行免疫亲和筛选,获得稳定表达的阳性菌株；提取阳性菌株的质粒,导入大肠杆菌HB2151中,经IPTG诱导表达,获得OTA单链抗体。结果显示,从小鼠脾细胞的基因组扩增出的VH和VL片段大小分别约为350bp和325bp左右,最终合成的ScFv片段大小约为750bp左右；利用噬菌体展示技术,经过五轮筛选,获得三株特异性分泌单链抗体的阳性菌株；对阳性菌质粒进行分析,最终确定ScFv基因核苷酸序列大小约为720-726bp左右,共编码242个氨基酸,重链约354-370bp,编码118～123个氨基酸,轻链约321-330bp,编码107～110个氨基酸；在HB2151中,OTA单链抗体最终以可溶性表达产物的形式表达于细胞周间质中,亲和纯化后,经WesternBlot鉴定具有抗原特异性,可用于后续实验。试验Ⅲ赭曲霉毒素A单链抗体的初步应用围绕本实验所制备的OTA单链抗体进行研究,采用间接非竞争ELISA法鉴定其亲和力,并确定偶联抗原最佳包被浓度及单链抗体最佳工作浓度；采用间接竞争ELISA法检测其灵敏度,计算检出限和50%抑制浓度(IC50)；对单链抗体与赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、黄曲霉毒素B1、伏马菌素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素以及OVA蛋白的交叉反应性进行检测；分别采用间接竞争ELISA法和高效液相法测定样品的加标回收率,对比评价OTA单链抗体构建间接竞争ELISA检测方法的可行性；最后对随机采集的市售样品分别采用间接竞争ELISA法和高效液相法进行检测。结果显示,本实验所制备的OTA单链抗体亲和常数为(2.21±0.31)xl07L·mo1-1,检出限为0.055ng-mL-1,IC50为1.125ng-mL-1;该方法的准确性较高,组内和组间平均变异系数分别为2.48%和4.05%；除OTB、OTC的交叉反应率为22.7%和14.1%之外,其余参试物质交叉反应率均小于0.01%；间接竞争ELISA法测定的加标回收率与高效液相色谱法的结果基本一致,其中11份大米的加标回收率为88.84%-93.67%,11份小麦的加标回收率为85.56%-94.33%；所检测的市售大米、小麦样品中,间接竞争ELISA法的阳性检出率分别为18.2%和36.4%,与高效液相色谱法的检测结果基本吻合。
【作者】顾舒舒；
【导师】张海彬；
【作者基本信息】南京农业大学，兽医，2013，硕士
【关键词】赭曲霉毒素A；单链抗体；制备；间接竞争ELISA法；检测；

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