萝卜芜菁花叶病毒（TuMV）抗性相关基因克隆与TRAP标记开发利用

【摘要】萝卜(RaphanussativusL.)是一种重要的世界性蔬菜作物,在我国栽培历史悠久分布广泛。萝卜不仅营养丰富,而且耐贮运、宜加工,一直深受人们喜爱。病毒病是危害萝卜的重要病害之一,而芜菁花叶病毒(TuMV)是造成萝卜病毒病的主要病原。由于在发病期间,TuMV常以非持久的方式通过有翅蚜进行传播,导致使用化学药剂来防治病害的方法很难达到理想的效果,同时很容易造成环境的污染。因此,大力开展萝卜抗病毒病的研究工作,筛选和培育抗病毒萝卜新品种是减轻病害最经济有效的对策。目前对于萝卜病毒病的研究主要集中在萝卜TuMV抗性遗传规律的研究,但由于采用的方法和材料不同,尚无一致性的结论,至今亦尚未见萝卜对TuMV抗病分子机理的研究。本研究以萝卜为材料,开发TuMV的RT-PCR’快速检测方法；利用同源克隆方法,克隆TuMV抗性相关基因；开发一种基于RGAs的TRAP分子标记用于萝卜抗性遗传多样性的研究等,以期对萝卜抗病毒病育种研究工作提供一定的理论依据。主要结果如下：(1)根据TuMVCP基因保守区设计、合成特异引物,建立RT-PCR方法快速检测萝卜中TuMV的技术体系。通过RT-PCR扩增、回收、测序,得到一条长384bp的片段,与预期的片段大小一致。BLAST分析显示,其与已报道的TuMV序列的相应位置的同源性在95%以上,说明RT-PCR可用来特异地检测TuMV病毒。通过对不同萝卜材料及发病材料的不同部位,cDNA不同稀释倍数的检测,验证了RT-PCR技术特异性和灵敏度,证明TuMV在萝卜上的侵染是系统性侵染。(2)利用同源克隆的方法,成功地从萝卜中克隆到真核翻译起始因子4E基因RseIF4E及异构体RseIF(iso)4E。RseIF4E基因全长1483bp,cDNA全长696bp,编码232个氨基酸；RseIF(iso)4E基因的全长1205bp,cDNA全长594bp,编码198个氨基酸。同源性分析显示,两个基因在与mRNA帽子及4G作用的活性部位氨基酸高度保守。同时对12份不同萝卜品种的cDNA序列和氨基酸序列的比较分析显示这两个基因在不同萝卜品种间存在一定SNPs,InDel和片段插入。在线软件预测RseIF4E和RseIF(iso)4E蛋白属于细胞质中的亲水性蛋白。实时定量PCR检测表明：芜菁花叶病毒能够诱导萝卜RseIF4E和RseIF(iso)4E基因的转录表达,其诱导后的表达特征说明它可能参与寄主和病毒的互作。(3)开发了一种基于RGAs的TRAP分子标记,并用于30个萝卜品种的遗传多样性分析。通过数据开发的方法,从公共数据库中筛选出50条RGAs(35条unigenes和15条单一的ESTs)用于设计固定引物。59条符合固定引物设计最优条件的引物被筛选出来和随机引物组合,经’NAU-YH’和NAU-DY’的筛选,65对多态性引物组合被筛选出来用于遗传多样性分析。获得385条多态性条带,通过UPGMA方法构建的聚类图将30份萝卜品种分为4组,和萝卜的TuMV抗性评估结果具有很高的一致性。同时,手工绘制品种鉴别图(CID),4对引物组合区分开了30个萝卜品种。结果表明,TRAP标记是一种有效的遗传标记,可用于构建萝卜的遗传图谱,在萝卜育种计划中可以作为一种标记辅助选择手段。
【作者】程丹丹；
【导师】龚义勤；柳李旺；
【作者基本信息】南京农业大学，蔬菜学，2013，硕士
【关键词】萝卜；芜菁花叶病毒(TuMV)；RT-PCR；真核生物翻译起始因子4E；目标区域扩增多态性(TRAP)；

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