镉抗性细菌Cupriavidus campinensis KQ46的分离鉴定及其镉抗性机制研究

【摘要】随着经济发展,重金属镉污染的问题日益严重,不断威胁着生态环境和人类健康。微生物在镉污染修复和治理中具有巨大的应用价值,而微生物镉抗性的高低是其应用范围的一个决定性因素,研究微生物的镉抗性机制可以为微生物更好应用于镉污染治理与修复提供理论支持。从南京市栖霞山铅锌矿区的镉污染土壤及其附近生长的镉超富集植物龙葵中共分离到72株镉抗性细菌,其中34株分离自土壤,20株分离自龙葵根部,18株分离自龙葵茎。测定了菌株对镉的最大耐受浓度(MTC)和抗生素抗性,并对菌株的16SrDNA序列进行了测定和比对,发现菌株KQ46可以耐受的Cd2+浓度为4mM,对卡那霉素和庆大霉素敏感,确定以菌株KQ46为寻找镉抗性相关基因的出发菌株。结合形态学观察和生理生化实验,初步鉴定KQ46为Cupriaviduscampinensis。以KQ46为供试菌株,利用mini-mariner转座子对其进行了随机插入突变,从5000个突变子中筛选到10株可以稳定生长且镉抗性能力降低突变株,镉耐受浓度分别由4mM降低到0.8-1.0mM。利用SEFAPCR方法扩增了每个突变株中转座子的侧翼序列,通过同源性比对分析,发现有6株突变株的转座子插入的基因分别与aroG、ppd、alkK、ppc、细胞色素c533合成基因以及Acyl-CoA转移酶基因高度同源,这6个基因均为基础生长代谢所需要的基因；其余4株突变株中转座子插入失活的基因分别可能为：hmp,与细胞抗逆性反应相关；hmyF,为重金属离子外排的辅助蛋白；组氨酸激酶基因,与细胞信号转导有关；fcuA,铁色素-铁离子复合物的受体蛋白。参考前人的研究结果后,认为fcuA可能与胞内Cd2+浓度调节有关,通过sau3Al随机酶切建库的方法获得了KQ46中fcuA基因的全序列(GenBankAccessionNo.KC776916)及其部分侧翼序列,构建了MT21的fcuA基因回补菌株DRfcuA。通过测定培养过程中菌株KQ46胞内Cd2+含量和培养基中Cd2+浓度并结合红外光谱分析,发现胞内和胞外Cd2+浓度在培养过程中基本维持恒定,培养12h和24h胞内镉含量分别为0.548±0.016mg/g和0.552±0.008mg/g,进入衰亡期后细胞对Cd2+吸收增多,含量为1.038±0.046mg/g,而红外光谱分析显示细胞表面并没有明显吸附有Cd2+,由此认为菌株KQ46主要依靠外排Cd2+来维持胞内Cd2+含量处于可耐受范围,从而产生镉抗性。同时对MT21和DRfcuA研究后发现虽然MT21和DRfcuA对镉的最大耐受浓度均为0.8mM,但在含有0.5mMCd2+的培养条件下从扫描电镜照片可以看出0.5mMCd2+对MT21毒害作用比DRfcuA明显,DRfcuA吸收的Cd2+仅为MT21的50%左右,不过仍然显著高于KQ46的吸收量,同时红外光谱分析显示在含有0.5mMCd2+的培养条件下MT21和DRfcuA的细胞在1735cm-1处具有红外吸收峰,推测可能为细胞表面的酮、醛、酯类中的C=O键与Cd2+结合所致。由此分析认为fcuA基因在CupriaviduscampinensisKQ46中具有调控胞内Cd2+含量的功能,但仍需要其上下游基因的共同作用,其具体作用机制还有待进一步研究。
【作者】朱宇辰；
【导师】盛下放；
【作者基本信息】南京农业大学，微生物学，2013，硕士
【关键词】镉抗性机制；转座子插入突变；基因克隆；fcuA；Cupriaviduscampinensis；

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